氯離子通道阻斷劑對STS誘導的心肌細胞凋亡的影響及信號轉(zhuǎn)導.pdf

1、細胞凋亡（apoptosis）參與了多種心血管疾病的發(fā)生及發(fā)展，如心肌梗死、心力衰竭及心律失常。心肌細胞為終末分化細胞，不具有分化潛能，因此抑制心肌細胞凋亡，保護心肌細胞正常功能對治療多種心血管疾病有重要意義。
　　凋亡又稱程序性細胞死亡（programmedcelldeath，PCD），是由基因控制的細胞主動死亡形式，伴有一系列的生化及形態(tài)學改變。細胞凋亡早期細胞體積減小即凋亡性容積減?。╝poptoticvolumedecre

2、ase，AVD），是凋亡的一個重要的形態(tài)學特征。近年來，大量證據(jù)提示AVD及激活的離子通道在細胞凋亡過程中起著重要的作用，是細胞凋亡的重要前提；在多種細胞，通過阻斷激活的離子通道及細胞體積減小可以抑制細胞凋亡。氯離子是機體內(nèi)最重要，最豐富的陰離子，膜片鉗證實細胞凋亡伴有氯離子電流激活，阻斷激活的氯離子電流能抑制減輕細胞凋亡，但是其內(nèi)在的信號機制尚不清楚。因此本實驗的目的是在建立心肌細胞凋亡模型的基礎上，觀察氯離子通道阻斷劑對細胞存活及凋

3、亡的影響，并首次探討了非特異性氯離子通道阻斷劑DIDS對細胞內(nèi)促存活信號通路PI3K/Akt及下游分子eNOS/NO（nitricoxide，NO），Bcl-2/Bax的影響。
　　研究目的：
　　1.原代培養(yǎng)SD大鼠乳鼠心肌細胞，經(jīng)典的線粒體途徑凋亡誘導劑staurosporine（STS）建立心肌細胞凋亡模型，觀察氯離子通道阻斷劑對心肌細胞存活及凋亡的影響。
　　2.STS誘導心肌細胞凋亡過程中，氯離子通道阻斷劑D

4、IDS對細胞存活信號通路PI3K/Akt及其下游分子eNOS/NO的影響。
　　3.氯離子通道阻斷劑DIDS對STS誘導心肌細胞凋亡的Bcl-2家族Bcl-2/Bax的影響。
　　實驗方法：
　　1.實驗設立陰性對照組（正常對照組），陽性對照組（誘導凋亡組）及實驗組（給予不同的氯離子通道阻斷劑）。
　　2.STS誘導心肌細胞凋亡，相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)學變化，Hoechst-33258染色觀察細胞核的形態(tài)學變化。

5、
　　3.四唑鹽（MTT）比色法觀察心肌細胞的存活率；底物酶解熒光法檢測caspase-3活性，反映心肌細胞的凋亡程度；DNA“梯”狀條帶（DNAladder）檢測心肌細胞凋亡的發(fā)生。
　　4.氯離子通道阻斷劑DIDS，NPPB及phloretin對STS處理心肌細胞存活率與凋亡的影響。
　　5.免疫印跡方法觀察氯離子通道阻斷劑DIDS對細胞促存活信號通路PI3K/Akt及其下游分子eNOS/NO的影響；硝酸還原酶法測

6、定細胞無酚紅培養(yǎng)上清NO水平。
　　6.免疫印跡方法觀察DIDS對Bcl-2/Bax表達的影響；免疫熒光雙染色觀察DIDS對STS處理的心肌細胞Bax分布的影響，免疫印跡法半定量DIDS對細胞線粒體及胞質(zhì)片斷Bax水平的影響。
　　實驗結(jié)果：
　　1.STS濃度依賴性，時間依賴性的降低了原代培養(yǎng)心肌細胞的存活率，升高了caspase-3活性；4μmol/LSTS處理8h細胞存活率為42.9％，caspase-3活性為4

7、.52，與正常對照組比較有顯著性差異（P＜0.01vs.control），DNA瓊脂糖凝膠電泳有明顯的DNA-ladder形成。正常心肌細胞，形態(tài)規(guī)則，搏動規(guī)律，而STS誘導的凋亡細胞，明顯皺縮變圓，細胞觸角減少，細胞間距增加，大多數(shù)細胞停止搏動。Hoechst-33258染色對照組心肌細胞核呈圓形或者橢圓形，染色均勻；STS處理細胞，大多數(shù)細胞核不規(guī)則，固縮，有明顯的核分葉和碎裂等典型的凋亡特征。說明4μmol/LSTS誘導8h可以成

8、功建立心肌細胞凋亡模型。
　　2.STS誘導凋亡的同時應用氯離子通道阻斷劑250μmol/LDIDS，100μmol/LNPPB，及30μmol/Lphloretin，細胞存活率分別為77.4％，70.1％及74.4％，與陽性對照組比較有顯著性差異（P＜0.01vs.control）；caspase-3活性較STS組明顯降低，且無明顯的DNA“梯”狀條帶形成；細胞形態(tài)較陽性對照組規(guī)則，Hoechst-33258染色陽性細胞明顯減少

9、。說明氯離子通道阻斷劑可以明顯抑制細胞凋亡，促進細胞存活。
　　3.氯離子通道阻斷劑可以明顯抑制STS誘導的心肌細胞凋亡，我們首次探討了非特異性的氯離子通道阻斷劑DIDS抑制細胞凋亡的分子學機制。蛋白免疫印跡發(fā)現(xiàn)在正常對照組，STS誘導凋亡組及DIDS與STS同時處理組，Akt的表達無明顯變化；但是與STS陽性對照組比較，同時應用DIDS明顯升高了p-Akt水平（P＜0.01vs.STS），LY294002預處理可以完全抑制p-A

10、kt的升高，而且可以阻斷DIDS提高細胞存活率、降低caspase-3活性的作用；但是單獨應用DIDS在1，2，4及8h四個時間點，p-Akt與對照組無明顯變化，說明DIDS并不能直接激活細胞內(nèi)PI3K/Akt信號。提示在STS誘導的心肌細胞，DIDS發(fā)揮抗凋亡作用可能與PI3K/Akt信號通路激活有關(guān)。
　　4.STS誘導細胞凋亡明顯降低了細胞內(nèi)eNOS及p-eNOS的水平，同時加入DIDS提高了eNOS，p-eNOS的水平（P

11、＜0.01vs.STS），LY294002預處理可以完全抑制DIDS的上述作用；eNOS通過促進NO生成對細胞起重要保護作用，為進一步證明eNOS在DIDS促細胞存活中的作用，硝酸還原酶法檢測了細胞培養(yǎng)上清NO水平，結(jié)果與p-eNOS一致，STS誘導細胞凋亡，NO水平較正常對照組明顯降低，當同時應用DIDS則明顯升高了細胞上清NO水平（P＜0.01vs.STS），應用LY294002預處理可以完全阻斷升高的NO，非特異性NOS阻斷劑L-

12、NAME預處理也可以清除DIDS升高的NO水平，但僅部分阻斷了DIDS的細胞保護作用（細胞存活率，caspase-3活性及DNA-ladder形成）。提示PI3K/Akt信號下游分子eNOS/NO升高部分參與了DIDS的抗凋亡作用。
　　5.DIDS對STS誘導心肌凋亡的Bcl-2，Bax表達無明顯影響。提示DIDS并非通過調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax表達發(fā)揮其抗凋亡作用。
　　6.應用免疫熒光雙染方法，激光共聚焦顯微鏡顯示，正常

13、細胞促凋亡蛋白Bax主要分布在細胞質(zhì)，STS誘導心肌細胞凋亡過程中伴有明顯的Bax蛋白線粒體轉(zhuǎn)位；DIDS可以抑制STS誘導的Bax線粒體轉(zhuǎn)位，而且可能與激活的PI3K/Akt信號通路存在內(nèi)在的聯(lián)系，PI3K的特異性阻斷劑LY294002預處理，細胞重新呈現(xiàn)Bax線粒體轉(zhuǎn)位。進一步通過分析細胞線粒體及胞質(zhì)片段Bax蛋白的水平，結(jié)果顯示正常細胞線粒體Bax處于較低水平；STS誘導細胞凋亡線粒體Bax的水平明顯升高，說明細胞凋亡過程中伴有明

14、顯的Bax線粒體轉(zhuǎn)位；STS誘導細胞同時應用DIDS可以明顯抑制線粒體Bax水平的升高，且PI3K的特異性阻斷劑LY294002預處理可以清除DIDS抑制Bax轉(zhuǎn)位的作用。進一步提示DIDS可能通過激活PI3K/Akt信號通路明顯抑制STS誘導的Bax蛋白線粒體轉(zhuǎn)位，也參與了DIDS的抗凋亡效應。
　　結(jié)論：
　　1.氯離子通道阻斷劑DIDS，NPPB及phloretin，能夠抑制STS誘導的心肌細胞凋亡，提高細胞存活率。<

15、br>　　2.DIDS通過激活PI3K/Akt信號通路發(fā)揮其抑制STS誘導的心肌細胞凋亡的作用；并首次證實激活的PI3K/Akt信號通路下游分子eNOS/NO部分參與了DIDS的抗凋亡、保護細胞的效應。
　　3.首次證明DIDS明顯抑制了STS誘導心肌細胞凋亡過程中促凋亡蛋白Bax由胞質(zhì)向線粒體的轉(zhuǎn)位，且可以被特異性PI3K阻斷劑LY294002預處理完全阻斷。提示DIDS抑制Bax蛋白線粒體轉(zhuǎn)位與激活的PI3K/Akt信號通路有