窖蛋白caveolin-1-3對心肌細胞容積敏感性氯離子通道功能的影響.pdf

1、容積敏感性氯離子通道全稱容積敏感性、外向整流性氯離子通道（volume-sensitive outward rectification chloride channel，VSOR Cl-channel），也被稱為容積調節(jié)的陰離子通道（volume-regulated anion channel，VRAC），大量分布在哺乳動物組織和細胞，參與了調節(jié)細胞體積、細胞增殖與分化、免疫反應、細胞膜電位、細胞內PH及凋亡等多種病理、生理過程。而且它

2、還參與了多種心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生和發(fā)展，如：阻斷VSOR Cl-通道可以延長動電位時程、心肌不應期而預防惡性心律失常，可以減輕缺血再灌注導致的心肌細胞損傷，抑制心肌肥厚，還可以減少梗死心肌的范圍，恢復心臟基本功能等。因此干預及調節(jié)VSOR Cl-通道的功能，能成為保護心肌的靶點。近年來由于對該通道的不斷深入研究，VSOR Cl-通道的主要編碼蛋白LRRC8A于2014年首次被發(fā)現(xiàn)了，為進一步研究VSOR Cl-通道打下了堅定的基礎。

3、r>　　最新研究表明VSOR Cl-通道不是直接被機械應力刺激激活，而是涉及了離子強度和細胞膜的緊張度的敏感性。該通道的激活不僅涉及到了胞內Ca2+及ATP水平，還涉及到窖蛋白（caveolin，Cav）、細胞膜的脂質構成、肌動蛋白細胞骨架和G蛋白等。而且研究發(fā)現(xiàn)，不僅離子通道本身，與之相結合的蛋白結構的異常和（或）功能的改變均可導致一系列的病理變化。其中發(fā)揮膜儲備作用的caveolin，也是最常見的細胞質膜上的離子通道結合蛋白。研究指

4、出，caveolin可以和陽離子通道K+，Na+， Ca2+等形成復合物，caveolin結構的改變及功能的異常，可以引起上述這些離子通道功能的異常，甚至引起系統(tǒng)疾病、離子通道病等。然而僅有幾例關于caveolin與陰離子通道關系的報道，目前尚無caveolin與VSOR Cl-通道編碼蛋白關系及其相關機制的研究。
　　因此，本研究擬：
　　（1）探討VSOR Cl-通道編碼蛋白LRRC8A在細胞膜上的具體定位，及其與cav

5、eolin的定位關系；
　?。?）進一步說明caveolin對VSOR Cl-通道功能的影響，是否調控了VSOR Cl-通道的開放，及如何發(fā)揮調控作用的？
　　目的：
　　1.探討Cav-1/3與LRRC8A在心肌細胞膜上的定位及二者定位關系。
　　2.探討Cav-1/3是否對心肌細胞VSOR Cl-通道的功能產(chǎn)生影響。
　　3.探討Cav-1/3對VSOR Cl-編碼蛋白LRRC8A表達水平的影響。

6、>　　方法：
　　1.實驗分組：等滲刺激，低滲刺激，實驗組（低滲刺激＋DIDS/低滲刺激+MβCD），Cav-1/3 siRNA+等滲刺激，Cav-1/3 siRNA+低滲刺激；
　　2.乳鼠心肌細胞的原代培養(yǎng)：常規(guī)分離乳鼠心臟、剪碎、消化、離心、重懸、差速貼壁及培養(yǎng)備用；
　　3.免疫熒光染色檢測心肌細胞膜上LRRC8A、Cav-1及Cav-3的定位；
　　4.蔗糖密度超速離心技術：獲取富含cveolin的片段

7、；
　　5.Western blot蛋白檢測技術：檢測目的蛋白LRRC8A，Cav-1，Cav-3的表達水平；
　　6.免疫共沉淀技術：檢測目的蛋白LRRC8A與Cav-1，及LRRC8A與Cav-3有無共沉淀；
　　7.膜片鉗全細胞記錄技術：檢測等滲、低滲、加入VSOR Cl-通道非特異性阻滯劑DIDS及caveolin破壞劑MβCD處理后，心肌細胞上ICl,vol電流的變化。
　　8. siRNA基因沉默技術

8、：含Cav-1或Cav-3基因的siRNA片段轉染H9C2心肌細胞系48-72h，重新貼壁，膜片鉗檢測ICl,vol電流的變化；及Western blot檢測LRRC8A膜蛋白隨著Cav-1基因沉默的變化。
　　9.流式細胞檢測技術：對H9C2心肌細胞系在等滲、低滲、低滲+MβCD等不同條件下檢測心肌細胞容積的變化，并繪制曲線圖。
　　10.MQAE氯離子熒光檢測技術：心肌細胞在等滲、低滲、低滲+DIDS、低滲+MβCD不同

9、條件下，觀察細胞熒光強度的變化及全波長酶標儀檢測不同組熒光值的變化。
　　11.Cav-1基因過表達、轉染技術：構建pCMV-myc-Cav-1載體、質粒合成、轉染心肌細胞系（H9C2），Western blot檢測LRRC8A膜蛋白隨著Cav-1蛋白過表達的變化。
　　結果：
　　1.免疫熒光染色技術顯示：熒光倒置顯微鏡下觀察，Cav-1/3（紅色），LRRC8A（綠色），黃色即提示二者分布一致，結果顯示Cav-1/

10、3與LRRC8A存在共定位關系。
　　2.選取原代培養(yǎng)的心肌細胞，利用蔗糖密度超速離心法，按照超聲離心物分層的結果，分別獲取1-12份不同比重的細胞沉淀物，離心、提取蛋白后，蛋白免疫印跡法顯示：Cav-1、Cav-3與LRRC8A均分布在相同比重的膜窖富集區(qū)條帶，并形成免疫共沉淀復合物，提示二者Cav-1/3與LRRC8A存在直接接觸的基礎。
　　3.低于正常滲透壓的外液（220 Osmol/kgH2O）灌流心肌細胞，VSO

11、R Cl-通道被激活，ICl,Vol電流逐漸增大并穩(wěn)定，電壓達到+80mV及以上時，具有時間、電壓依賴性失活，+100mV時計算ICl,Vol的密度為98.45±1.76pA/pF（n=5），在+40mV，+60mV，+80mV及+100mV時均可被DIDS呈電壓依賴性阻斷，I/V曲線提示該電流呈外向整流性，+100mV對ICl,Vol電流的抑制率為90.22±11.50％（P＜0.01 vs HYPO，n=5）。
　　4.同樣低

12、于正常滲透壓的外液（220 Osmol/kgH2O）灌洗原代培養(yǎng)的心肌細胞，記錄到陽性ICl,Vol電流后，再加入含有10mmol/L MβCD的低滲外液后，該電流在+40mV，+60mV，+80mV及+100mV時也可被MβCD呈電壓依賴性阻斷，+100mV時的電流密度為36.57±10.46 pA/pF，抑制率為91.86±12.70%（P＜0.01 vs HYPO，n=3）。
　　5.含2.5mmol/L MβCD的培養(yǎng)液預

13、孵育細胞半小時，實驗前給予含有相同濃度MβCD的低滲外液，記錄到的 ICl,Vol電流明顯減少，在+40mV，+60mV，+80mV及+100mV時，該電流呈現(xiàn)出明顯的電壓依賴性阻斷，+100mV時的電流密度為25.95±4.75pA/pF，MβCD對ICl,Vol的抑制率為89.19±8.35%（P＜0.01 vs HYPO， n=4）。
　　6.應用Cav-1的siRNA及Cav-3的siRNA處理H9C2心肌細胞系72h后，

14、置低滲灌流液中，在siRNA沉默Cav-1組，未能記錄到陽性電流，+100mV時的電流密度為28.53±7.04pA/pF，抑制率達到78.27±7.93%（n=4，P＜0.01 vs HYPO），而在siRNA沉默Cav-3組，可記錄到陽性ICl,Vol電流，+100mV時的電流密度為77.85±3.04pA/pF，較低滲組無明顯差異（P＞0.05 vs HYPO，n=4）。
　　7.在等滲、低滲、低滲+MβCD等不同條件下處理

15、H9C2細胞1h后，流式細胞儀檢測細胞體積，結果顯示：與低滲組比較，低滲+MβCD組細胞體積未見明顯增大，提示caveolin可能通過干預VSPR Cl-通道的功能，而發(fā)揮調節(jié)細胞體積的作用。
　　8.應用MQAE檢測細胞內Cl-濃度，結果顯示：低滲組熒光強度最強，低滲+DIDS組及低滲+MβCD組熒光強度均較低滲組明顯減弱（P＜0.01，n=6），而低滲+DIDS組與低滲+MβCD組比較，胞內Cl-熒光強度相當，無統(tǒng)計差異（P＞

16、0.05，n=6）。
　　9.應用Cav-1的siRNA處理后，LRRC8A膜蛋白相應減少，統(tǒng)計存在顯著性差異（P＜0.05，n=6）；過表達Cav-1后，LRRC8A膜蛋白表達無明顯增加，統(tǒng)計學無顯著差異（P＞0.05，n=6）。
　　結論：
　　1.Cav-1/3與LRRC8A位于心肌細胞的膜窖內，呈現(xiàn)共定位關系。
　　2.破壞及干擾掉caveolin，可以顯著減弱低滲刺激下心肌細胞的容積敏感性氯電流、阻止了