胰島素對(duì)大鼠缺氧-復(fù)氧和缺血-再灌注心肌細(xì)胞損傷的影響及細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究.pdf

1、第一部分 胰島素對(duì)新生大鼠缺氧后復(fù)氧心肌細(xì)胞損傷影響及細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究 第一節(jié)新生大鼠體外心肌細(xì)胞培養(yǎng)和缺氧/復(fù)氧模型建立 目的： 通過(guò)體外培養(yǎng)新生大鼠心肌細(xì)胞，構(gòu)建新生大鼠心肌缺氧/復(fù)氧損傷模型，在細(xì)胞水平模擬大鼠心肌缺血再灌注(SI/R)損傷，為研究胰島素對(duì)新生大鼠缺氧/復(fù)氧損傷影響提供平臺(tái)。 方法： 分離新生1-3天的乳鼠心室肌，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)3-4天后，行缺氧2h/復(fù)氧4h

2、，建立缺氧/復(fù)氧(anoxia/reoxygenation)心肌細(xì)胞損傷模型。在缺氧前、缺氧2h末期和復(fù)氧4h末期利用2，4二硝基苯肼顯色法檢測(cè)乳酸脫氫酶(LDH)活性，硫代巴比妥酸顯色法檢測(cè)丙二醛(MDA)含量并進(jìn)行比較，以證實(shí)缺氧/復(fù)氧損傷模型構(gòu)建成功。 結(jié)果： 新生1-3天的乳鼠心室肌，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)3-4天后，在倒置顯微鏡下可觀察到有搏動(dòng)的心肌細(xì)胞。培養(yǎng)3-4天的心肌細(xì)胞在實(shí)施缺氧期2h后，LDH和MDA均較缺氧

3、前有所升高(P＜0.01)；而給予復(fù)氧期4h后，LDH和MDA明顯高于缺氧期(P＜0.01)，對(duì)照組的上述指標(biāo)在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)未見(jiàn)明顯改變(P＞0.05)。結(jié)論： 通過(guò)給新生大鼠體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞行缺氧2h/復(fù)氧4h后，可明顯造成心肌細(xì)胞損傷，以此模擬大鼠心肌缺血再灌注損傷。 第二節(jié)胰島素對(duì)新生大鼠缺氧后復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡、Akt表達(dá)影響及機(jī)制研究 目的： 通過(guò)新生大鼠缺氧/復(fù)氧損傷模型，觀察胰島素對(duì)新生大鼠

4、缺氧后復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡、Akt的影響，探討其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。 方法： 通過(guò)給原代培養(yǎng)乳鼠心室肌細(xì)胞行缺氧2h/復(fù)氧4h，建立缺氧/復(fù)氧(anoxia/reoxygenation)心肌細(xì)胞損傷模型。于復(fù)氧期開(kāi)始分別給予0.9％生理鹽水(VC組)、胰島素(INS組)、LY294002(LY組)、胰島素+LY294002(INS+LY組)干預(yù)。于復(fù)氧4h后，利用2，4二硝基苯肼顯色法檢測(cè)乳酸脫氫酶(LDH)活性，硫代巴比妥酸

5、顯色法檢測(cè)丙二醛(MDA)含量，原位末端標(biāo)記法(TUNEL)和DNA梯帶法(DNALadder)標(biāo)測(cè)細(xì)胞凋亡，免疫印跡法(Westernblotting)檢測(cè)磷酸化Akt表達(dá)，并比較各組間差異。 結(jié)果： 與VC組相比，INS組中LDH活性、MDA含量、凋亡指數(shù)(AI)顯著降低(P＜0.01)，磷酸化Akt表達(dá)明顯增加(P＜0.01)；但上述指標(biāo)變化可被LY294002(PI3K抑制劑)所抑制。 結(jié)論： 在

6、復(fù)氧早期給予胰島素干預(yù)可顯著地減少缺氧后復(fù)氧所誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，其保護(hù)機(jī)制與PI3K/Akt信號(hào)通路所介導(dǎo)的抗細(xì)胞凋亡作用有關(guān)。 第二部分 胰島素對(duì)大鼠缺血后再灌注心肌保護(hù)作用及其與GIK比較研究 目的： 通過(guò)比較胰島素和極化液(GIK)對(duì)大鼠缺血后再灌注心肌LDH、MDA、IS/AAR％以及LVEDP的影響，探討胰島素在GIK成分中的作用以及調(diào)節(jié)代謝以外的保護(hù)機(jī)制。 方法： 結(jié)扎SD大

7、鼠左冠狀動(dòng)脈前降支(LAD)30min，復(fù)灌LAD180min，建立大鼠缺血再灌注模型，將58只SD雄性大鼠隨機(jī)分組為：缺血期組(Ⅰ組，12只)，缺血再灌注組(I/R組，12只)，假手術(shù)組(SHAM組，10只)，胰島素處理組(INS組，12只)，GIK處理組(GIK組，12只)。假手術(shù)組給予冠脈穿線(不結(jié)扎)；缺血期組給予缺血30min，不給予再灌注；其它組分別在再灌注前5min給予生理鹽水、胰島素、GIK干預(yù)。用硫代巴比妥酸顯色法檢測(cè)

8、心肌組織中丙二醛(MDA)含量；用2，4二硝基苯肼顯色法檢測(cè)血漿中乳酸脫氫酶酶(LDH)活性；用TTC染色檢測(cè)心肌梗塞范圍(IS/AAR％)；檢測(cè)左室舒張末壓(LVEDP)評(píng)價(jià)心功能并進(jìn)行組間比較。 結(jié)果： 1)I/R組中MDA值、LDH值、IS/AAR％和LVEDP均明顯高于Ⅰ組(P＜0.01)；2)與I/R組相比，INS組和GIK組均可明顯降低MDA值(P＜0.01)、LDH值(P＜0.01)，減少心肌IS/AAR％

9、(P＜0.05)，降低LVEDP(P＜0.05)；3)上述指標(biāo)在INS組和GIK組間未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)論： 1)大鼠心肌缺血后再灌注可導(dǎo)致MDA值、LDH值、IS/AAR％和LVEDP升高；2)胰島素在缺血后再灌注損傷中可能具有一定的抗氧化作用；3)胰島素抗心肌缺血后再灌注損傷作用可能不完全依賴于對(duì)能量代謝的調(diào)節(jié)。 第三部分 胰島素對(duì)大鼠缺血后再灌注心肌細(xì)胞凋亡、Bad表達(dá)影響及機(jī)制研究 目的：

10、 觀察胰島素對(duì)大鼠缺血后再灌注心肌細(xì)胞凋亡及促凋亡蛋白Bad磷酸化表達(dá)的影響，以進(jìn)一步探討胰島素在缺血再灌注損傷中的抗凋亡機(jī)制。 方法： 46只SD雄性大鼠隨機(jī)分為四組：1)缺血再灌注對(duì)照組(I/R，n=12只)，實(shí)施30min缺血/180min再灌注；2)胰島素組(INS，n=12只)，于再灌注期前5min頸靜脈內(nèi)輸注胰島素(60U/L，4ml/kg.h)至灌注期結(jié)束；3)胰島素+LY294002組(INS+L

11、Y，n=12)，再灌注前10min靜脈注射LY294002(0.3mg/kg)，5min后再靜脈輸注胰島素+LY294002(30ug/kg/hr)；4)假手術(shù)組(SHAM，n=10只)：僅給予冠脈穿線，不實(shí)施結(jié)扎。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用原位末端標(biāo)記法(TUNEL)和DNA梯帶法(DNALadder)標(biāo)測(cè)細(xì)胞凋亡，用免疫組化和Western-blotting法檢測(cè)磷酸化Bad(pBad)表達(dá)。 結(jié)果： 1)與SHAM組相比，I/

12、R組凋亡指數(shù)(AI)明顯增加(P＜0.01)，pBad表達(dá)降低(P＜0.05)；2)與I/R組相比，INS組AI值明顯減少(P＜0.01)，pBad表達(dá)升高(P＜0.01)；3)與INS組相比，INS+LY組AI值明顯增加(P＜0.01)，pBad表達(dá)降低(P＜0.05)。 結(jié)論： 1)缺血再灌注可導(dǎo)致心肌組織pBad低表達(dá)；2)胰島素對(duì)大鼠在體缺血再灌注心肌有明顯抗凋亡作用；3)PI3K/Akt/Bad途徑可能為胰島素