鹽酸多奈哌齊在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中抗炎機(jī)制及保護(hù)作用的研究.pdf

1、目的：
　　研究不同濃度的鹽酸多奈哌齊(Donepezil)對OA患者軟骨細(xì)胞生存率的影響，篩選出其最佳的藥物作用濃度，觀察其對TNF-α產(chǎn)生毒性的拮抗作用;觀察最適濃度的Donepezil對TNF-α處理后的軟骨細(xì)胞的基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix Metalloproteinase，MMP)13和蛋白聚糖酶ADAMTS-5的基因表達(dá)，以及白介素6(IL-6)、白介素1β(IL-1β)前列腺素E2(PGE2)和NO分泌水平的影響;

2、研究最佳濃度的Donepezil對TNF-α處理后的軟骨細(xì)胞MAPKs信號通路（P38、ERK1/2和JNK磷酸化）的影響;研究Donepezil對TNF-α處理后的STAT1/IRF-1通路的影響;研究構(gòu)建組織工程軟骨，研究Donepezil對TNF-α造成的組織工程軟骨的過度降解的保護(hù)作用;進(jìn)一步探討Donepezil對OA軟骨降解的保護(hù)作用和可能涉及的機(jī)制。
　　方法：
　　1.實驗步驟
　　1.1細(xì)胞培養(yǎng):從O

3、A患者行膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的膝關(guān)節(jié)股骨髁獲取軟骨組織，并進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)和傳代，獲取3-5代細(xì)胞用于進(jìn)行后續(xù)實驗。
　　1.2設(shè)定六個Donepezil濃度組(0、5、10、20、40、80μM)，和5個TNF-α濃度組(0、2.5、5、10、20ng/ml)，觀察各濃度組Donepezil對軟骨細(xì)胞生存的影響，然后篩選出對細(xì)胞毒性最大的TNF-α的濃度。
　　1.3以Donepezil預(yù)處理，繼而以TNF-α處理人軟骨細(xì)胞，q-

4、PCR法測定MMP-13和ADAMTS-5的mRNA表達(dá)狀況，并酶聯(lián)免疫吸附法測定細(xì)胞上清液中的IL-1β、IL-6、PGE2的含量，Greiss法測定細(xì)胞上清液的NO的含量。
　　1.4以TNF-α處理人軟骨細(xì)胞，以Donepezil干預(yù)，Western Blot法檢測MAPKs通路(p38、ERK1/2、JNK)的磷酸化狀況。
　　1.5以TNF-α處理人軟骨細(xì)胞，以Donepezil為干預(yù)，以化學(xué)制劑SB203580(

5、p38inhibitor)，PD98059(ERK1/2 inhibitor)，分別阻斷p38、ERK1/2、JNK通路，ELISA檢測細(xì)胞IL-1β、IL-6、PEG2的分泌情況，Greiss法測定細(xì)胞上清液的NO的含量。
　　1.6以TNF-α處理人軟骨細(xì)胞，以Donepezil干預(yù)，觀察其對STAT l/IRF-1通路的影響。
　　1.7將軟骨細(xì)胞接種在多孔納米PLLA支架上，構(gòu)建組織工程軟骨，以TNF-α處理人軟骨細(xì)

6、胞，以Donepezil干預(yù)，通過Safranin O染色來觀察細(xì)胞支架復(fù)合物的蛋白聚糖表達(dá)情況，通過免疫組化染色和WB觀察復(fù)合物中的Ⅱ型膠原，通過DMMB法測量復(fù)合物中糖胺聚糖(GAG)含量，通過免疫熒光觀察復(fù)合物中的軟骨細(xì)胞的SOX-9的表達(dá)，以此觀察Donepezil預(yù)防TNF-α所造成的軟骨細(xì)胞基質(zhì)降解的情況。
　　結(jié)果：
　　1.1 Donepezil對軟骨細(xì)胞活力的影響
　　實驗結(jié)果顯示:20μM以下的Do

7、nepezil對細(xì)胞的活力無任何影響（P＞0.05，與對照組相比較）。40、80μM濃度組對細(xì)胞生長有抑制作用(P＜0.05，與對照組細(xì)胞比較)。而TNF-α濃度組(0、2.5、5、10、20ng/ml)中，10ng/mL的TNF-α對細(xì)胞活性抑制的最為明顯。和單純TNF-α處理組比較，以Donepezil干預(yù)可大大提高細(xì)胞的活性(P＜0.05)。
　　1.2 Donepezil對TNF-α誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞的MMP-13 mRNA和

8、ADAMTS-5的影響。軟骨細(xì)胞以10、20μMDonepezil預(yù)處理24h再加入10ng/mL的TNF-α收集細(xì)胞行q-PCR。單純TNF-α處理組相比，Donepezil組的MMP-13 mRNA和ADAMTS-5表達(dá)水平明顯降低。
　　1.3 Donepezil對TNF-α誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞上清液中的IL-1β、IL-6、PGE2和NO的分泌的影響。軟骨細(xì)胞以10、20μMDonepezil預(yù)處理24h加入10ng/mL的TN

9、F-α，刺激72h收集細(xì)胞上清液行ELISA檢測和Greiss檢測。結(jié)果顯示，與TNF-α處理組相比，Donepezil可使TNF-α誘導(dǎo)產(chǎn)生的IL-1β、IL-6、PGE2和NO的分泌顯著性下降。
　　1.4 Donepezil對TNF-α誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞的STAT1/IRF、P-p38、P-ERK1/2和P-JNK表達(dá)的影響。
　　TNF-α誘導(dǎo)組的p38、ERK1/2和JNK的磷酸化明顯增加。而經(jīng)Donepezil干預(yù)后

10、，P38和ERK1/2的通路的磷酸化明顯受到抑制，而Donepezil對JNK通路的磷酸化并沒有影響。
　　1.5 Donepezil以及MAPKs(ERK，p38)通路抑制劑對IL-1β、IL-6、PGE2和NO的影響。
　　1.6免疫熒光顯示，TNF-α的刺激會引起IRF-1因子的表達(dá)，IRF-1的siRNA可，而Donepezil的干預(yù)可以抑制STAT1因子的上調(diào)，進(jìn)而抑制IRF-1通路的激活。IRF-1的上調(diào)可特異性

11、的引起MMP-13的表達(dá)，而Donepezil可特異性的削弱由IRF-1上調(diào)引起的MMP-13的表達(dá)。
　　1.7 Donepezil對TNF-a導(dǎo)致的組織工程軟骨復(fù)合物基質(zhì)降解的保護(hù)作用
　　免疫組化結(jié)果顯示，Donepezil干預(yù)組復(fù)合物比單純TNF-α處理組的Ⅱ型膠原特異性染色更強(qiáng)。Safranin O染色提示Donepezil干預(yù)組的蛋白多聚糖的積累多于單純TNF-α處理組。且DMMB法測的Donepezil干預(yù)組的

12、糖胺聚糖(GAG)同樣多于單純TNF-α處理組(P＜0.01)。經(jīng)過Donepezil干預(yù)后的軟骨支架復(fù)合物的SOX-9的表達(dá)明顯多于單純TNF-α處理組。
　　結(jié)論：
　　1.10、20μM濃度的Donepezil對細(xì)胞的生長無影響，可作為后續(xù)實驗的干預(yù)濃度，10ng/mL的TNF-α對軟骨細(xì)胞的毒性最大，可作為后續(xù)實驗的負(fù)性處理因素，且Donepezil的干預(yù)可以逆轉(zhuǎn)TNF-α造成的軟骨細(xì)胞的活力下降。
　　2.D

13、onepezil可以顯著的下調(diào)由TNF-α誘導(dǎo)產(chǎn)生的MMP-13和ADAMTS-5的mRNA的表達(dá)。
　　3.Donepezil可以顯著的下調(diào)由TNF-α誘導(dǎo)產(chǎn)生的IL-1β、IL-6、PGE2和NO的分泌增加。
　　4.Donepezil可以抑制TNF-α導(dǎo)致的MAPK-p38和ERK1/2的磷酸化。但是對TNF-α引起的JNK通路的活化沒有任何作用。
　　5.和其它信號通路抑制劑相比，Donepezil可以抑制的由