復(fù)元膠囊對(duì)實(shí)驗(yàn)性骨關(guān)節(jié)炎的軟骨保護(hù)作用研究.pdf

1、目的： 觀察中藥復(fù)方制劑-復(fù)元膠囊(簡(jiǎn)稱FYC)對(duì)兔膝骨關(guān)節(jié)炎(OA)模型關(guān)節(jié)軟骨的組織形態(tài)學(xué)及MMP-13、TIMP-1、TIMP-2、IL-1β、TGF-β2表達(dá)的影響；研究FYC含藥血清對(duì)軟骨細(xì)胞增殖和P38信號(hào)通路的干預(yù)作用，探討FYC對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變的防治作用及可能的作用機(jī)理。 方法： 1．選用健康新西蘭大白兔66只，用改良Hulth法制備兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型，以FYC灌胃為干預(yù)治療手段，觀察各組股骨內(nèi)髁

2、關(guān)節(jié)軟骨大體、光鏡和電鏡下的病理變化。采用免疫組化法檢測(cè)退變膝關(guān)節(jié)軟骨MMP-13、TIMP-2、IL-1β及TGF-β2的蛋白質(zhì)水平，RT-PCR法檢測(cè)MMP-13、TIMP-1、TIMP-2mRNA的表達(dá)。從骨關(guān)節(jié)炎軟骨的破壞因素和保護(hù)因素，從mRNA轉(zhuǎn)錄水平到蛋白質(zhì)表達(dá)水平，多層次、多角度觀察FYC對(duì)骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變的影響。 2．選用健康21-28d齡SD大鼠，用酶消化法原代培養(yǎng)軟骨細(xì)胞，給予不同濃度的FYC含藥血清(0％

3、、5％、10％、20％)刺激第3代軟骨細(xì)胞，作用時(shí)間分別為24h、48h、72h，采用MTT法檢測(cè)FYC含藥血清對(duì)軟骨細(xì)胞的增殖，根據(jù)OD值選擇FYC含藥血清的最佳作用濃度和最佳作用時(shí)間納入后續(xù)試驗(yàn)。細(xì)胞化學(xué)免疫法檢測(cè)Ⅱ型膠原表達(dá)以鑒定軟骨細(xì)胞。采用Western blot法研究FYC含藥血清對(duì)軟骨細(xì)胞中p-p38和MMP-13表達(dá)的干預(yù)作用，從信號(hào)通路的途徑，探討 FYC防治骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變的可能作用機(jī)制。 結(jié)果：

4、 1．FYC對(duì)兔膝OA組織形態(tài)學(xué)的影響 正常組股骨髁關(guān)節(jié)軟骨光滑如常，改良Hulth術(shù)后4W時(shí)出現(xiàn)股骨內(nèi)髁軟骨面糜爛，骨贅形成，軟骨細(xì)胞器腫脹或破裂，核染色質(zhì)凝集等一系列OA的病理改變。術(shù)后8、12W時(shí)上述病理改變隨造模時(shí)間的延長(zhǎng)而加重，大體評(píng)分和Mankin’s評(píng)分與正常組比較有顯著差異(p<0.05)。12W時(shí)FYC中、高劑量組能明顯抑制兔膝OA的軟骨退變，低劑量組以及4、8W時(shí)中、高劑量組均不能阻止軟骨形態(tài)學(xué)改變。

5、 2．FYC對(duì)兔膝OA軟骨中MMP-13、TIMP-2、IL-1β和TGF-β2的影響 免疫組化顯示：模型組全層軟骨胞漿中均有MMP-13表達(dá)，染色呈深棕色，4W時(shí)模型組MMP-13比正常組明顯升高，兩組間有顯著差異(p<0.01)。模型組8W時(shí)與4W時(shí)比較反而有所下降。8、12W時(shí)FYC中、高劑量組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目少，淺染，細(xì)胞分?jǐn)?shù)與模型組比較有顯著差異(p<0.01)。 4、8、12W時(shí)FYC高劑量組TIMP-2

6、陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比模型組多，染色深，其細(xì)胞分?jǐn)?shù)與模型組比較有顯著差異(p<0.05)。8W時(shí)FYC中劑量組細(xì)胞分?jǐn)?shù)與模型組比較有顯著差異(p<0.05)。 4、8、12W時(shí)模型組全層軟骨胞漿中均有IL-1β表達(dá)，為深棕褐色。4W時(shí)FYC低、中、高劑量組IL-1β細(xì)胞分?jǐn)?shù)均低于模型組(p<0.05)，組間無(wú)明顯差異；8W時(shí)FYC中、高劑量組IL-1β細(xì)胞分?jǐn)?shù)均低于模型組，與模型組比較皆有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；12W時(shí)FYC中、高劑

7、量組與模型組比較有顯著差異(p<0.01)，并隨劑量增加而顯著下降。 正常組全層軟骨細(xì)胞胞漿中均有TGF-β2陽(yáng)性表達(dá)。4W時(shí)模型組關(guān)節(jié)軟骨陽(yáng)性細(xì)胞減少，12W時(shí)陽(yáng)性細(xì)胞更少，4、8、12W時(shí)模型組與正常組間比較有顯著差異(P<0.05)。4W時(shí)FYC中、高劑量組的表達(dá)同低劑量組比較，無(wú)明顯差異(p>0.05)；8、12W時(shí)FYC中、高劑量組TGF-β2的細(xì)胞分?jǐn)?shù)與模型組比較有顯著差異(P<0.05)。 3．FYC對(duì)兔膝OA軟

8、骨中MMP-13、TIMP-1、TIMP-2mRNA表達(dá)的影響 4W時(shí)正常組關(guān)節(jié)軟骨MMP-13mRNA中等量表達(dá)(0.98±0.23)，隨時(shí)間延長(zhǎng)變化不大。4W時(shí)模型組MMP-13mRNA的水平明顯增高(1.32±0.11)，8、12W時(shí)模型組比4W時(shí)模型組有所下降。4、12W時(shí)FYC低、中劑量組與模型組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)；8W時(shí)低、中劑量組(0.96±0.03，0.94±0.04)與模型組(1.24±0.06)

9、比較有顯著差異(p<0.05)；4W時(shí)FYC高劑量組與模型組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)；8、12W時(shí)FYC高劑量組MMP-13mRNA水平明顯降低(0.70±0.01，0.51±0.02)，與模型組比較有顯著差異(p<0.05)。 4W時(shí)正常組軟骨TIMP-1mRNA的表達(dá)較多(2.86±0.65)，隨時(shí)間延長(zhǎng)變化不大。4W時(shí)模型組表達(dá)與正常組比較變化不大，8、12W時(shí)模型組表達(dá)明顯減少，與正常組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.

10、05)。8、12W時(shí)FYC高劑量組TIMP-1mRNA的表達(dá)高于四環(huán)素組。12W時(shí)FYC中劑量組和8、12W時(shí)FYC高劑量組TIMP-1mRNA的表達(dá)比模型組增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。 4W時(shí)正常組軟骨TIMP-2 mRNA表達(dá)較多(0.89±0.2)，隨時(shí)間延長(zhǎng)變化不大。4、8、12W時(shí)模型組表達(dá)明顯降低，與正常組比較有顯著差異(p<0.05)。8W時(shí)FYC高劑量組和12W時(shí)FYC中、高劑量組TIMP-2mRN

11、A的表達(dá)比模型組增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。試驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)TIMP-1與TIMP-2的變化不一致。 4．FYC含藥血清對(duì)軟骨細(xì)胞增殖的影響 48h時(shí)結(jié)果顯示，5％、10％、20％FYC含藥血清對(duì)軟骨細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用，無(wú)遞增效應(yīng)。10％、20％FYC含藥血清與5％空白血清組比較，有顯著差異(p<0.05)；5％FYC含藥血清組與5％空白血清組比較無(wú)明顯差異(p>0.05)。72h時(shí)結(jié)果顯示，5％、10％、

12、20％FYC含藥血清對(duì)軟骨細(xì)胞增殖也有促進(jìn)作用，但不及48h時(shí)的作用佳。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)48h和72h時(shí)的10％FYC含藥血清組作用強(qiáng)于20％FYC含藥血清組。MTT法顯示：10％FYC含藥血清組在48h時(shí)，10ng/mlIL-1β對(duì)軟骨細(xì)胞增殖的抑制作用最強(qiáng)。 5．FYC含藥血清對(duì)軟骨細(xì)胞p38信號(hào)通路的影響 FYC含藥血清能夠抑制p-p38蛋白在軟骨細(xì)胞中的表達(dá)。10％FYC組與10％空白血清組比較差異顯著(p<0.05)

13、。在IL-1β的刺激下，10％空白血清+IL-1β組和10％FYC+IL-1β組比較有顯著差異(p<0.05)。 FYC含藥血清能夠抑制MMP-13在軟骨細(xì)胞中的表達(dá)。MMP-13在10％空白血清組和10％FYC組的表達(dá)較正常組明顯增加，10％FYC組與10％空白血清組比較有明顯差異(p<0.01)。FYC抑制IL-1β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上的p-p38的表達(dá)，但抑制P38MAPK通路后，MMP-13的表達(dá)并未減少。 結(jié)論：

14、 1．FYC對(duì)Hulth模型所致的骨關(guān)節(jié)炎軟骨損傷有明顯的保護(hù)作用。通過(guò)FYC不同劑量組、四環(huán)素組與模型組在關(guān)節(jié)軟骨的外觀、組織學(xué)評(píng)分、軟骨組織超微結(jié)構(gòu)的比較，表明FYC能降低軟骨損傷的組織學(xué)評(píng)分，減緩膠原降解、抑制軟骨退變。以8、12周時(shí)中、高劑量組的療效最為明顯。 2．FYC能抑制兔膝OA關(guān)節(jié)軟骨MMP-13的活化，促進(jìn)TIMP1、TIMP-2的生成，調(diào)節(jié)MMPs/TIMPs的平衡。 3．FYC能抑制兔膝OA關(guān)節(jié)