復(fù)元膠囊通過MAPKs通路調(diào)節(jié)OPg-RANKL-RANK系統(tǒng)防治骨關(guān)節(jié)炎的實驗研究.pdf

1、第一部分 IL-1β和1α.25(OH)2D3對OPG-RANKL-RANK系統(tǒng)影響機(jī)制的實驗研究
　　目的:明確OA軟骨細(xì)胞中MAPKs通路與OPG-RANKL-RANK系統(tǒng)的關(guān)系。
　　方法:以SW1353細(xì)胞為研究對象，分為9組。分別以IL-1β、1α.25(OH)2D3、 p38信號通路抑制劑SB203580，ERK1/2信號通路抑制劑PD980959和JNK信號通路抑制劑SP600125對SW1353進(jìn)行干預(yù)，模型

2、組細(xì)胞分別以IL-1β、1α.25(OH)2D3誘導(dǎo)后不做任何處理。Western blot法檢測磷酸化p38(p-p38)、磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)、磷酸化JNK(p-JNK)蛋白的表達(dá)。qRT-PCR法檢測OPG、RANKL和RANKmRNA的表達(dá)。ELISA法檢測OPG、RANKL蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:Western blot法結(jié)果顯示IL-1β誘導(dǎo)SW1353后，p-p38、p-ERK1/2、p-JNK的蛋

3、白水平高于正常組。各通路抑制劑均能抑制其活化。1α.25(OH)2D3誘導(dǎo)SW1353后，p-ERK1/2水平顯著高于正常組，而p-p38和p-JNK低于正常組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。SB203580組、PD98059組p-p38、p-JNK表達(dá)與模型組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)。qRT-PCR和ELISA法結(jié)果顯示IL-1β誘導(dǎo)SW1353后，OPG、RANKL、RANK mRNA和蛋白的表達(dá)和OPG/RANKL比

4、值高于正常組。SB203580組OPG mRNA、蛋白水平和OPG/RANKL比值低于模型組，而RANK mRNA、RANKL mRNA和蛋白量高于模型組;PD98059組OPG/RANKL比值高于模型組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)，而OPG mRNA、蛋白水平高于模型組，RANK mRNA、RANKL mRNA和蛋白水平低于模型組，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05);SP600125組RANKL、OPG mRNA和蛋白、RAN

5、K mRNA表達(dá)明顯低于模型組，OPG/RANKL比值高于模型組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。1α.25(OH)2D3誘導(dǎo)SW1353后，OPG mRNA、蛋白的水平和OPG/RANKL比值低于正常組，RANKL mRNA和蛋白，RANK mRNA表達(dá)高于正常組。PD98059組OPG mRNA、蛋白的水平和OPG/RANKL比值高于模型組，RANKL mRNA和蛋白，RANK mRNA表達(dá)低于模型組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜

6、0.05)。SB203580組和SP600125組OPG，RANKL，和RANK表達(dá)較模型組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)。
　　結(jié)論:MAPKs通路可調(diào)節(jié)OA軟骨細(xì)胞OPG、RANKL、RANK的水平。
　　第二部分:OPG對人軟骨細(xì)胞增殖和凋亡影響的實驗研究
　　目的:明確OPG對軟骨細(xì)胞的作用及機(jī)制。
　　方法:予以不同濃度的重組人OPG-Fc作用于SW1353，MTT法檢測細(xì)胞生存率，并篩選OPG-F

7、c的最佳作用濃度和時間納入后續(xù)試驗。以SW1353為研究對象，分為7組。分別以O(shè)PG-Fc、SB203580和PD980959對SW1353進(jìn)行干預(yù)。Western blot法檢測p-p38、p-ERK1/2蛋白的表達(dá)。qRT-PCR法檢測Bax、Bcl-2和caspase3mRNA的表達(dá)。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期。
　　結(jié)果:MTT結(jié)果提示:25ng/ml、50ng/ml的OPG-Fc能夠促進(jìn)SW1353細(xì)胞增殖，且50ng/ml

8、組優(yōu)于25ng/ml組。而100ng/mlOPG促進(jìn)細(xì)胞凋亡。其中以72h作用顯著。Western blot法結(jié)果顯示，OPG-Fc誘導(dǎo)SW1353后，50ng/mlOPG-Fc組p-p38蛋白水平低于正常組，p-ERK1/2蛋白水平高于正常組，而100ng/ml組p-p38表達(dá)高于正常組，p-ERK1/2低于正常組。qRT-PCR法結(jié)果顯示，50ng/mlOPG-Fc組Bax、caspase3 mRNA和Bax/Bcl-2比值水平低于

9、正常組，Bcl-2mRNA水平高于正常組，可被PD98059抑制;100ng/mlOPG-Fc組Bax、caspase3mRNA和Bax/Bcl-2比值水平高于正常組，而Bcl-2mRNA表達(dá)低于正常組，可被SB203580拮抗。流式細(xì)胞結(jié)果顯示50ng/mlOPG-Fc組細(xì)胞增殖指數(shù)(PI)高于正常組，可被PD98059抑制;100ng/mlOPG-Fc組PI低于正常組，可被SB203580拮抗，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。<

10、br>　　結(jié)論:OPG通過MAPKs通路調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞的增殖/凋亡，其作用因OPG濃度的改變而改變。
　　第三部分:淫羊藿苷通過MAPKs通路對OPG-RANKL-RANK系統(tǒng)影響的實驗研究
　　目的:觀察淫羊藿苷對OPG-RANKL-RANK系統(tǒng)的影響。
　　方法:予以不同濃度的Icariin作用于SW1353，MTT法檢測細(xì)胞生存率，并篩選Icariin的最佳作用濃度和時間納入后續(xù)試驗。以SW1353為研究對象，分為

11、7組。分別以IL-1β、SB203580、PD980959和Icariin對SW1353進(jìn)行干預(yù)，模型組細(xì)胞以IL-1β誘導(dǎo)后不做任何處理。Western blot方法檢測p-p38、p-ERK1/2蛋白的表達(dá)。qRT-PCR法檢測OPG、RANKL和RANKmRNA的表達(dá)。ELISA法檢測OPG、RANKL蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:MTT結(jié)果顯示，3μg/ml、6μg/ml、12μg/ml淫羊藿苷促進(jìn)細(xì)胞增殖，呈劑量-時間依賴性，

12、以12μg/ml48h促細(xì)胞增殖效果最好。Western blot法結(jié)果顯示，淫羊藿苷干預(yù)后，p-p38蛋白的表達(dá)低于模型組，p-ERK1/2的表達(dá)高于模型組。qRT-PCR和ELISA法結(jié)果顯示Icariin組OPG、RANKLmRNA和蛋白、RANKmRNA和OPG/RANKL的表達(dá)低于模型組，SB203580能增強(qiáng)Icariin下調(diào)的OPG和OPG/RANKL水平，但PD98059能抑制此過程，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。

13、
　　結(jié)論:淫羊藿苷能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖。調(diào)控MAPKs通路。下調(diào)OPG、RANKL、RANK和OPG/RANKL的水平。
　　第四部分:復(fù)元膠囊通過MAPKs通路對OPG-RANKL-RANK系統(tǒng)影響的實驗研究
　　目的:觀察復(fù)元膠囊對OPG-RANKL-RANK系統(tǒng)的影響，探討其治療OA的作用機(jī)制。
　　方法:予以不同濃度的FYC-CS作用于SW1353，MTT法檢測細(xì)胞生存率，并篩選Icariin的最佳作

14、用濃度和時間納入后續(xù)試驗。以SW1353為研究對象，分為9組。分別以IL-1β、1α.25(OH)2D3、PD980959、正常兔血清和FYC-CS對SW1353細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，模型組細(xì)胞分別以IL-1β組、1α.25(OH)2D3誘導(dǎo)后不做任何處理，Western blot法檢測p-ERK1/2蛋白的表達(dá)。qRT-PCR法檢測OPG、RANKL和RANKmRNA的表達(dá)。ELISA法檢測OPG、RANKL蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:MT

15、T結(jié)果顯示，5％-15％FYC-CS能促進(jìn)細(xì)胞增殖，但20％、25％FYC-CS組細(xì)胞增殖減弱。以15％的FYC-CS，48h促細(xì)胞增殖效果最好。Western blot法結(jié)果顯示IL-1β誘導(dǎo)SW1353后，F(xiàn)YC-CS組p-ERK1/2高于模型組。1α.25(OH)2D3誘導(dǎo)SW1353后，F(xiàn)YC-CS組p-ERK1/2水平低于模型組，qRT-PCR和ELISA法結(jié)果顯示，IL-1β誘導(dǎo)SW1353后，F(xiàn)YC-CS組0PG、RANK

16、LmRNA和蛋白、RANKmRNA和OPG/RANKL表達(dá)低于模型組，PD98059有拮抗FYC-CS的作用;1α.25(OH)2D3誘導(dǎo)SW1353后，F(xiàn)YC-CS組OPGmRNA和蛋白、OPG/RANKL水平高于模型組，RANKLmRNA和蛋白和RANKmRNA水平低于模型組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。
　　結(jié)論:(1)復(fù)元膠囊能夠明顯促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖。通過ERK1/2通路調(diào)節(jié)OPG，RANKL，RANK和OPG/R