miR-15a在人膝關節(jié)軟骨細胞中的表達及其對軟骨細胞增殖與凋亡作用的研究.pdf

1、背景：
　　骨關節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是一種常見的關節(jié)退行性疾病,又稱骨關節(jié)病、退行性關節(jié)炎。其病情進展與年齡相關,發(fā)病緩慢,對中老年人群的生活質量產生嚴重的影響,是老年人致殘的重要因素。隨著我國老齡化進程的加快,骨關節(jié)炎對家庭和全社會的影響和負擔日益突出。骨關節(jié)炎的病因復雜,其危險因素包括年齡、體重、關節(jié)創(chuàng)傷等,目前對其發(fā)病機制還缺乏較深入的了解,不能較完整地闡明其本質。骨關節(jié)炎主要累及全身各活動關節(jié),以髖關

2、節(jié)、膝關節(jié)、踝關節(jié)等負重關節(jié)最為多見,其主要病理特征為受累關節(jié)的軟骨細胞數量減少、關節(jié)軟骨基質遭到破壞,病變涉及滑膜細胞、軟骨、軟骨下骨以及周圍肌肉韌帶等軟組織,最終導致患者關節(jié)變形,關節(jié)功能障礙。
　　microRNA即微小RNA,是近年來發(fā)現的一類內源性的非編碼單鏈RNA分子,進化上高度保守,長約17～25個核苷酸。microRNA廣泛存在于動物植物體內,并能夠以堿基互補配對的方式與其靶基因mRNA結合,進而降解靶基因或者抑制

3、靶基因翻譯過程,起到轉錄后調控的作用,是體內基因表達調控的重要分子。大量研究表明,microRNA參與調控炎癥、腫瘤、生長發(fā)育等多種病理及生理過程,與此同時其在骨關節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展及治療中所起到的作用值得我們進一步深入了解。本實驗以miR-15a為研究重點,探索其是否對骨關節(jié)炎的發(fā)病起到了調控作用。
　　目的：
　　1.驗證miR-15a在正常人膝關節(jié)軟骨細胞和骨關節(jié)炎軟骨細胞中的差異表達;
　　2.明確miR-15a對

4、體外原代培養(yǎng)的人膝關節(jié)軟骨細胞增殖與凋亡的影響;
　　3.明確 miR-15a對Ⅱ型膠原等功能蛋白在軟骨細胞中表達的影響,初步闡釋miR-15a在骨關節(jié)炎發(fā)生發(fā)展中起到的作用,為骨關節(jié)炎分子靶向治療提供潛在的靶點和理論依據。
　　方法：
　　1.采用酶兩步消化法獲取并原代培養(yǎng)正常人膝關節(jié)軟骨細胞,細胞單層爬片后采用甲苯胺藍染色法、Ⅱ型膠原免疫細胞化學染色加以鑒定。
　　2.采用酶兩步消化法獲取并原代培養(yǎng)正常人膝關

5、節(jié)軟骨細胞與人骨關節(jié)炎軟骨細胞,熒光實時定量PCR檢測miR-15a在兩種細胞中的表達量。
　　3.利用Lipofectamine2000轉染試劑將人工化學合成的miR-15a模擬物(mimics)、無關陰性對照序列(Negative Control)瞬時轉染原代培養(yǎng)的正常人膝關節(jié)軟骨細胞,熒光實時定量PCR檢測miR-15a在各實驗組細胞中的表達。
　　4.轉染miR-15a模擬物后,MTT比色法檢測miR-15a對軟骨細

6、胞增殖的影響。
　　5.轉染miR-15a模擬物后,流式細胞術檢測miR-15a對軟骨細胞凋亡的影響。
　　6.轉染miR-15a模擬物后,Western blot檢測miR-15a對軟骨細胞Ⅱ型膠原表達水平的影響。
　　結果：
　　1.采用酶兩步消化法獲得了原代人膝關節(jié)軟骨細胞,經甲苯胺藍染色法、Ⅱ型膠原免疫細胞化學染色鑒定后,其純度及生物學活性符合后續(xù)實驗要求。
　　2.熒光實時定量PCR檢測miR-1

7、5a在正常人膝關節(jié)軟骨細胞與人骨關節(jié)炎軟骨細胞中的表達量,結果顯示 miR-15a在兩種軟骨細胞中差異表達,并且在骨關節(jié)炎軟骨細胞中表達量明顯增高,P<0.05。
　　3.利用Lipofectamine2000轉染試劑,成功將miR-15a模擬物轉染至體外培養(yǎng)的軟骨細胞內,熒光顯微鏡下觀察轉染率大于90％,滿足后續(xù)實驗要求。
　　4.MTT實驗結果提示與對照組相比,轉染miR-15a模擬物后軟骨細胞增殖速率顯著降低,P<0.

8、05。
　　5.流式細胞術實驗結果提示與對照組相比,轉染miR-15a模擬物后軟骨細胞凋亡率顯著增高,P<0.05。
　　6.Western blot結果提示與對照組相比,轉染miR-15a模擬物后軟骨細胞Ⅱ型膠原表達水平顯著降低,P<0.05。
　　結論：
　　1.采用酶兩步消化法可成功獲得原代正常人膝關節(jié)軟骨細胞與原代人骨關節(jié)炎膝關節(jié)軟骨細胞,經鑒定后細胞純度與所具有的功能表型可用于后續(xù)細胞學實驗。
　

9、　2.miR-15a在正常人膝關節(jié)軟骨細胞與人骨關節(jié)炎軟骨細胞中差異表達,在正常關節(jié)軟骨細胞中表達量顯著低于骨關節(jié)炎軟骨細胞。
　　3.化學合成的miR-15a模擬物可高效地轉染進體外培養(yǎng)的關節(jié)軟骨細胞,可在96h內顯著提高細胞內miR-15a的表達量。
　　4.miR-15a可抑制軟骨細胞增殖,促進軟骨細胞凋亡,提示miR-15a在骨關節(jié)炎的發(fā)病過程中扮演了重要的角色。
　　5.miR-15a可通過抑制軟骨細胞中Ⅱ型