Sedlin蛋白對人軟骨細胞增殖的影響及作用機制.pdf

1、第一部分靶向增強、干擾人軟骨細胞SEDL基因，基因芯片檢測細胞內(nèi)骨發(fā)育相關基因表達變化
　　目的:靶向增強或者干擾人軟骨細胞SEDL基因，骨再生PCR芯片檢測細胞內(nèi)骨發(fā)育相關基因表達變化，為進一步研究SEDT發(fā)病機制提供高通量信息。
　　方法:采用定向克隆及大腸桿菌內(nèi)同源重組的方法分別構建靶向增強SEDL的腺病毒質粒pAd5-SEDL和靶向干擾SEDL的慢病毒質粒LV-siSEDL，分別導入293T細胞包裝成重組腺病毒pAd

2、5-SEDL和重組慢病毒LV-siSEDL，酶切鑒定（課題組前期已完成）。HEK293細胞擴增重組腺病毒，收集病毒液，檢測病毒滴度。將重組腺病毒、重組慢病毒以最適感染復數(shù)(Multiplicity of infection，MOI)分別感染HC-a，實驗分4組:增強組（HC-a/pAd5-SEDL）、增強陰性對照組(HC-a/ pAd5空載體)、干擾組(HC-a/ LV-siSEDL)、干擾組陰性對照組(HC-a/LV空載體)，收集4組

3、細胞mRNA進行骨再生PCR芯片檢測。
　　結果:1、收獲高滴度重組腺病毒pAd5-SEDL，病毒滴度為2.6×1011 pfu/ml。
　　2、重組腺病毒和重組慢病毒成功感染HC-a，重組腺病毒對HC-a的MOI值為50，重組慢病毒對HC-a的MOI值為20。
　　3、基因芯片結果:SEDL基因表達改變導致其上下游基因表達發(fā)生變化，其中與軟骨生長發(fā)育密切相關的基因有:COL2A、CD36、FLT1、GDF10、IGF

4、1等。
　　結論:SEDL基因與骨發(fā)育相關，軟骨細胞內(nèi)SEDL基因表達變化引起細胞內(nèi)與骨發(fā)育相關的基因表達改變，如COL2A等。
　　第二部分 Sedlin蛋白對人軟骨細胞增殖的影響及作用機制初步研究
　　目的:結合基因芯片篩選出來的差異基因，探索Sedlin蛋白對人軟骨細胞增殖的影響及作用機制，進一步探索X-連鎖遲發(fā)型脊柱骨骺發(fā)育不良的發(fā)病機制。
　　方法:實驗分為增強組(感染pAd5-SEDL的HC-a)、干

5、擾組(感染LV-SEDLsi的HC-a)、空白對照組(HC-a)。應用MTT法檢測三組HC-a的增殖活性;QPCR檢測三組HC-a中SEDL基因和COL2A基因mRNA表達;Western blot檢測三組HC-a中sedlin蛋白表達;細胞免疫組化檢測三組HC-aⅡ型膠原蛋白表達。
　　結果:1、與空白對照組相比，增強組HC-a細胞增殖活性增高，干擾組細胞增殖受到明顯抑制(P＜0.05)。
　　2、QPCR結果顯示增強組H

6、C-a SEDL基因表達量最高，空白對照組其次，干擾組HC-a表達量明顯降低(P＜0.001)。三組細胞COL2AmRNA表達量中，增強組明顯高于空白對照組和干擾組，干擾組表達量最低(P＜0.001)。
　　3、三組HC-a中，增強組sedlin蛋白表達最高，其次為空白對照組，干擾組表達量最低(P＜0.001)。
　　4、免疫組化結果顯示三組HC-a中，增強組Ⅱ型膠原蛋白的表達量最高，空白對照組其次，干擾組HC-a內(nèi)幾乎不表