氧化性低密度脂蛋白對(duì)破骨細(xì)胞增殖及分化的影響.pdf

1、背景:
　　動(dòng)脈粥樣硬化(atheromsclerosis，AS)是心腦血管系統(tǒng)疾病中最為常見(jiàn)也最為重要的一種，其臨床特點(diǎn)一般表現(xiàn)為動(dòng)脈內(nèi)膜的脂質(zhì)沉積，進(jìn)而導(dǎo)致斑塊形成，纖維組織增生和鈣鹽的沉積，最終導(dǎo)致動(dòng)脈的管壁變硬、管腔狹窄，并引起一系列繼發(fā)性病變。臨床研究顯示，ox-LDL在整個(gè)動(dòng)脈粥樣硬化(AS)形成和發(fā)展過(guò)程中起了重要作用。ox-LDL是血漿中LDL經(jīng)動(dòng)脈壁細(xì)胞氧化后產(chǎn)生多種活性醛類(lèi)，再與LDL載脂蛋白(apoB)中賴(lài)氨

2、酸殘基結(jié)合形成的產(chǎn)物，可被巨噬細(xì)胞的清道夫受體識(shí)別而快速攝取，促進(jìn)巨噬細(xì)胞形成泡沫細(xì)胞，從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化(AS)的發(fā)生。
　　骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis，OP)是一種以骨量減少、骨微觀結(jié)構(gòu)退化為特征，致使骨脆性增加并易于發(fā)生骨折的一種全身性骨骼疾病。有學(xué)者認(rèn)為成骨細(xì)胞(Osteoblast，OB)的退變，造成骨形成最佳條件缺陷，最終使骨組織結(jié)構(gòu)及力學(xué)特征改變，從而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥。還有學(xué)者證實(shí)通過(guò)測(cè)定骨形成和骨吸收表面

3、，認(rèn)為骨質(zhì)疏松癥成骨過(guò)程正常，而破骨活動(dòng)顯著活躍。無(wú)論哪種情況都說(shuō)明骨質(zhì)疏松癥是因?yàn)槌晒羌?xì)胞和破骨細(xì)胞之間的動(dòng)態(tài)平衡被打破，骨吸收遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)骨形成所導(dǎo)致的。破骨細(xì)胞(Osteoclast，OC)是人體生理性骨重建和病理性骨破壞過(guò)程中高度特異性且唯一具有骨質(zhì)吸收功能的多核巨細(xì)胞，其來(lái)源于骨髓單核巨噬細(xì)胞系。破骨細(xì)胞的活性改變是導(dǎo)致各種代謝性骨病的主要原因，也是研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。有研究顯示老年婦女的骨量丟失比較嚴(yán)重的會(huì)同時(shí)表現(xiàn)出嚴(yán)重的腹主動(dòng)脈

4、及冠狀動(dòng)脈硬化;排除體重指數(shù)、年齡、激素、吸煙等因素后，美國(guó)墨西哥裔老年女性和男性頸動(dòng)脈IMT厚度及骨密度呈負(fù)相關(guān)性;老年男性O(shè)P組比非OP組頸動(dòng)脈硬化病變（粥樣斑塊、IMT增厚）的發(fā)生率明顯增高，并隨著AS的程度加重而更加明顯;非骨質(zhì)疏松組IMT比骨質(zhì)疏松組薄，隨著年齡的增加，頸動(dòng)脈IMT越來(lái)越厚，骨密度越來(lái)越低。山此可推測(cè)OP與AS具有相關(guān)性，它們之間可能存在著共同危險(xiǎn)因素。還有學(xué)者認(rèn)為OP與AS之間并無(wú)相關(guān)性。為了進(jìn)一步明確兩者之

5、間的關(guān)系，特進(jìn)行此研究。
　　目的:
　　研究氧化性低密度脂蛋白(Ox-LDL)對(duì)破骨細(xì)胞增殖及分化的影響，為進(jìn)一步研究動(dòng)脈粥樣硬化和骨質(zhì)疏松癥之間的關(guān)系提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　1.離心后收集健康人血漿，通過(guò)密度梯度離心法制得LDL提取液，氧化、調(diào)整蛋白濃度為50mg/L。通過(guò)銅氧化法制得氧化性低密度脂蛋白。通過(guò)測(cè)定TBA（硫代巴比妥酸）反應(yīng)物質(zhì)的含量（MDA藥盒）鑒定其氧化修飾程度。
　　2.將R

6、aw264.7細(xì)胞株復(fù)蘇后，用RPMI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，視細(xì)胞生長(zhǎng)情況進(jìn)行傳代、凍存等。待細(xì)胞培養(yǎng)至所需細(xì)胞數(shù)量后，更換含RANKL的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，分別進(jìn)行觀察和鑒定:(1)直接用倒置相差顯微鏡觀察活細(xì)胞的形態(tài)和數(shù)量的變化(2)參照TRAP染色試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)誘導(dǎo)前后細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察，光鏡下計(jì)算TRAP陽(yáng)性破骨細(xì)胞總數(shù)，細(xì)胞數(shù)大于等于3個(gè)為T(mén)RAP(+)，染色陽(yáng)性細(xì)胞為破骨細(xì)胞。MTT法測(cè)定其對(duì)破骨細(xì)胞增殖及分化能力的影響。

7、r>　　結(jié)果:
　?、俦咏Y(jié)構(gòu)濃度測(cè)定結(jié)果:LDL的測(cè)得值是1.20±0.41 umol/g蛋白，Ox-LDL的測(cè)得值是20.58+0.65umol/g蛋白。②倒置相差顯微鏡觀察Raw264.7細(xì)胞的一般特點(diǎn)，細(xì)胞形態(tài)呈圓形、橢圓形、梭形、星形或不規(guī)則形，圓形為主。細(xì)胞核1-2個(gè)，單個(gè)核多見(jiàn)。具有很強(qiáng)的貼壁性，胰酶-EDTA難以消化，常聚集生長(zhǎng)。隨誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)胞體積逐漸增大，細(xì)胞形態(tài)以不規(guī)則形多見(jiàn)，圓形少見(jiàn)，細(xì)胞核為多個(gè)。T

8、RAP染色陽(yáng)性細(xì)胞為細(xì)胞質(zhì)鮮紅色或者淡紅色，細(xì)胞核2-3個(gè)多見(jiàn)，形態(tài)呈多突起不規(guī)則形。③不同濃度氧化性低密度脂蛋白干預(yù)破骨細(xì)胞后MTT法檢測(cè)說(shuō)明:氧化性低密度脂蛋白(Ox-LDL)可促進(jìn)破骨細(xì)胞的增殖及分化，其對(duì)破骨細(xì)胞的促進(jìn)作用在一定濃度范圍內(nèi)具有濃度依賴(lài)性:不同濃度的Ox-LDL對(duì)破骨細(xì)胞的增殖及分化的影響有差別:Ox-LDL濃度分別為100 mg/L，150 mg/L，200 mg/L時(shí)，破骨細(xì)胞抑制率分別為0.65±0.732，

9、0.48±0.068，0.31±0.039，均低于對(duì)照組（1.28±0.147，P＜0.05）。而Ox-LDL濃度為25 mg/L及50mg/L時(shí)，破骨細(xì)胞抑制率分別為1.134±0.120和1.189±0.112，較對(duì)照組無(wú)顯著差別。
　　結(jié)論:
　　不同濃度的Ox-LDL作用于破骨細(xì)胞產(chǎn)生的增殖及分化作用是不同的;
　　相同的作用時(shí)間下，低濃度的Ox-LDL對(duì)破骨細(xì)胞的增殖及分化無(wú)顯變化，在一定范圍內(nèi)隨著Ox-LD