氧化性低密度脂蛋白對破骨細(xì)胞增殖及分化的影響.pdf

1、背景:
　　動脈粥樣硬化(atheromsclerosis，AS)是心腦血管系統(tǒng)疾病中最為常見也最為重要的一種，其臨床特點一般表現(xiàn)為動脈內(nèi)膜的脂質(zhì)沉積，進(jìn)而導(dǎo)致斑塊形成，纖維組織增生和鈣鹽的沉積，最終導(dǎo)致動脈的管壁變硬、管腔狹窄，并引起一系列繼發(fā)性病變。臨床研究顯示，ox-LDL在整個動脈粥樣硬化(AS)形成和發(fā)展過程中起了重要作用。ox-LDL是血漿中LDL經(jīng)動脈壁細(xì)胞氧化后產(chǎn)生多種活性醛類，再與LDL載脂蛋白(apoB)中賴氨

2、酸殘基結(jié)合形成的產(chǎn)物，可被巨噬細(xì)胞的清道夫受體識別而快速攝取，促進(jìn)巨噬細(xì)胞形成泡沫細(xì)胞，從而促進(jìn)動脈粥樣硬化(AS)的發(fā)生。
　　骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis，OP)是一種以骨量減少、骨微觀結(jié)構(gòu)退化為特征，致使骨脆性增加并易于發(fā)生骨折的一種全身性骨骼疾病。有學(xué)者認(rèn)為成骨細(xì)胞(Osteoblast，OB)的退變，造成骨形成最佳條件缺陷，最終使骨組織結(jié)構(gòu)及力學(xué)特征改變，從而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥。還有學(xué)者證實通過測定骨形成和骨吸收表面

3、，認(rèn)為骨質(zhì)疏松癥成骨過程正常，而破骨活動顯著活躍。無論哪種情況都說明骨質(zhì)疏松癥是因為成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞之間的動態(tài)平衡被打破，骨吸收遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過骨形成所導(dǎo)致的。破骨細(xì)胞(Osteoclast，OC)是人體生理性骨重建和病理性骨破壞過程中高度特異性且唯一具有骨質(zhì)吸收功能的多核巨細(xì)胞，其來源于骨髓單核巨噬細(xì)胞系。破骨細(xì)胞的活性改變是導(dǎo)致各種代謝性骨病的主要原因，也是研究的熱點和重點。有研究顯示老年婦女的骨量丟失比較嚴(yán)重的會同時表現(xiàn)出嚴(yán)重的腹主動脈

4、及冠狀動脈硬化;排除體重指數(shù)、年齡、激素、吸煙等因素后，美國墨西哥裔老年女性和男性頸動脈IMT厚度及骨密度呈負(fù)相關(guān)性;老年男性O(shè)P組比非OP組頸動脈硬化病變（粥樣斑塊、IMT增厚）的發(fā)生率明顯增高，并隨著AS的程度加重而更加明顯;非骨質(zhì)疏松組IMT比骨質(zhì)疏松組薄，隨著年齡的增加，頸動脈IMT越來越厚，骨密度越來越低。山此可推測OP與AS具有相關(guān)性，它們之間可能存在著共同危險因素。還有學(xué)者認(rèn)為OP與AS之間并無相關(guān)性。為了進(jìn)一步明確兩者之

5、間的關(guān)系，特進(jìn)行此研究。
　　目的:
　　研究氧化性低密度脂蛋白(Ox-LDL)對破骨細(xì)胞增殖及分化的影響，為進(jìn)一步研究動脈粥樣硬化和骨質(zhì)疏松癥之間的關(guān)系提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　1.離心后收集健康人血漿，通過密度梯度離心法制得LDL提取液，氧化、調(diào)整蛋白濃度為50mg/L。通過銅氧化法制得氧化性低密度脂蛋白。通過測定TBA（硫代巴比妥酸）反應(yīng)物質(zhì)的含量（MDA藥盒）鑒定其氧化修飾程度。
　　2.將R

6、aw264.7細(xì)胞株復(fù)蘇后，用RPMI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，視細(xì)胞生長情況進(jìn)行傳代、凍存等。待細(xì)胞培養(yǎng)至所需細(xì)胞數(shù)量后，更換含RANKL的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，分別進(jìn)行觀察和鑒定:(1)直接用倒置相差顯微鏡觀察活細(xì)胞的形態(tài)和數(shù)量的變化(2)參照TRAP染色試劑盒說明書對誘導(dǎo)前后細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察，光鏡下計算TRAP陽性破骨細(xì)胞總數(shù)，細(xì)胞數(shù)大于等于3個為TRAP(+)，染色陽性細(xì)胞為破骨細(xì)胞。MTT法測定其對破骨細(xì)胞增殖及分化能力的影響。

7、r>　　結(jié)果:
　?、俦咏Y(jié)構(gòu)濃度測定結(jié)果:LDL的測得值是1.20±0.41 umol/g蛋白，Ox-LDL的測得值是20.58+0.65umol/g蛋白。②倒置相差顯微鏡觀察Raw264.7細(xì)胞的一般特點，細(xì)胞形態(tài)呈圓形、橢圓形、梭形、星形或不規(guī)則形，圓形為主。細(xì)胞核1-2個，單個核多見。具有很強(qiáng)的貼壁性，胰酶-EDTA難以消化，常聚集生長。隨誘導(dǎo)時間延長細(xì)胞體積逐漸增大，細(xì)胞形態(tài)以不規(guī)則形多見，圓形少見，細(xì)胞核為多個。T

8、RAP染色陽性細(xì)胞為細(xì)胞質(zhì)鮮紅色或者淡紅色，細(xì)胞核2-3個多見，形態(tài)呈多突起不規(guī)則形。③不同濃度氧化性低密度脂蛋白干預(yù)破骨細(xì)胞后MTT法檢測說明:氧化性低密度脂蛋白(Ox-LDL)可促進(jìn)破骨細(xì)胞的增殖及分化，其對破骨細(xì)胞的促進(jìn)作用在一定濃度范圍內(nèi)具有濃度依賴性:不同濃度的Ox-LDL對破骨細(xì)胞的增殖及分化的影響有差別:Ox-LDL濃度分別為100 mg/L，150 mg/L，200 mg/L時，破骨細(xì)胞抑制率分別為0.65±0.732，

9、0.48±0.068，0.31±0.039，均低于對照組（1.28±0.147，P＜0.05）。而Ox-LDL濃度為25 mg/L及50mg/L時，破骨細(xì)胞抑制率分別為1.134±0.120和1.189±0.112，較對照組無顯著差別。
　　結(jié)論:
　　不同濃度的Ox-LDL作用于破骨細(xì)胞產(chǎn)生的增殖及分化作用是不同的;
　　相同的作用時間下，低濃度的Ox-LDL對破骨細(xì)胞的增殖及分化無顯變化，在一定范圍內(nèi)隨著Ox-LD