車(chē)前子多糖對(duì)氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)的大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的疾病，特別是心腦血管硬化，在發(fā)達(dá)國(guó)家屬于死亡率最高的疾病。近年來(lái)，我國(guó)心腦血管硬化的發(fā)病率也逐年增加。目前，AS缺乏根治性的方法，臨床以降低血脂，調(diào)節(jié)脂代謝為主要手段，效果并不理想。大量實(shí)驗(yàn)證明，氧化修飾在AS發(fā)病機(jī)制中占有重要地位，越來(lái)越受到人們的重視。動(dòng)脈內(nèi)膜處的LDL（loW density lipoprotein，LDL）極易受到內(nèi)膜細(xì)胞產(chǎn)生的氧自由基及

2、代謝中間產(chǎn)物的影響，發(fā)生氧化形成氧化型低密度脂蛋白（oxidized low densitv lipoprotein， ox-LDL）。ox-LDL可通過(guò)多種途徑損傷血管內(nèi)皮，促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞（Vascular Smooth Muscle Cells，VSMC）的增殖和泡沫細(xì)胞的形成。因此，抑制ox-LDL的生成或降低ox-LDL對(duì)機(jī)體的損傷是預(yù)防AS發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵。中藥多糖有很強(qiáng)的生物活性，可調(diào)控細(xì)胞分裂和分化，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤

3、、抗氧化、抗病毒等藥理作用，因此，中藥多糖研究已成為生物化學(xué)領(lǐng)域中研究的熱點(diǎn)之一。本實(shí)驗(yàn)主要探討車(chē)前子多糖（plantain seed polysaccharide，PSP）對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制，為AS的防治提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。
　　 一大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的體外培養(yǎng)及其鑒定
　　 目的：探討以簡(jiǎn)便、高效的方法獲取VSMC，為相關(guān)研究提供實(shí)驗(yàn)材料。
　　 方法：（1） VSMC的原代

4、培養(yǎng)：無(wú)菌條件下取出胸主動(dòng)脈，立即置于含有D-Hank's液的培養(yǎng)皿中，去除內(nèi)膜和外膜，然后將中膜組織剪切成1 mm×1 mm大小的組織塊貼于培養(yǎng)瓶底面。加入含20％胎牛血清的培養(yǎng)液，將培養(yǎng)瓶倒置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中放置1～2h，待組織塊干涸并與瓶壁貼附，將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)繼續(xù)靜置培養(yǎng)3～5d。（2） VSMC的傳代培養(yǎng)：待原代培養(yǎng)的細(xì)胞達(dá)到80％融合時(shí)即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。加入胰蛋白酶消化，將培養(yǎng)瓶放于倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓翻

5、轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，吸棄消化液，加入含20％胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化，將細(xì)胞一分為二接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。（3） VSMC的鑒定：①倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)、貼壁及生長(zhǎng)情況。②抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白免疫組織化學(xué)方法鑒定VSMC。
　　 結(jié)果：（1）原代細(xì)胞生長(zhǎng)狀況及形態(tài)學(xué)變化：原代培養(yǎng)4～7d，少數(shù)組織塊需繼續(xù)培養(yǎng)至2～3周，可見(jiàn)到組織塊周?chē)屑?xì)胞游出。倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞形態(tài)多樣，呈梭形、三角形或不規(guī)則形。胞體較小，大小略有差

6、異。（2）傳代細(xì)胞生長(zhǎng)狀況及形態(tài)學(xué)變化：傳代平滑肌細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶12h后，細(xì)胞基本都已貼壁生長(zhǎng)。培養(yǎng)1～2周左右，形態(tài)多呈梭形，并相互交織排列而呈現(xiàn)典型的“峰-谷”狀生長(zhǎng)。（3）抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白免疫組織化學(xué)方法鑒定VSMC；經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)染色后，平滑肌細(xì)胞胞漿染成棕黃色，呈陽(yáng)性反應(yīng)，高倍鏡下可見(jiàn)胞漿內(nèi)大量棕黃色、與細(xì)胞長(zhǎng)軸平行的纖維肌絲，即平滑肌α-肌動(dòng)蛋白，核卵圓形居中，呈淡藍(lán)色。
　　 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)采用組織貼塊法成功地

7、培養(yǎng)了VSMC，經(jīng)光鏡觀察培養(yǎng)的主動(dòng)脈VSMC具有平滑肌細(xì)胞特征，免疫組織化學(xué)染色鑒定進(jìn)一步證實(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞是VSMC。
　　 二車(chē)前子多糖對(duì)氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)的大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的影響
　　 目的：探討PSP對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的大鼠主動(dòng)脈VSMC增殖的影響及其可能的作用機(jī)制。
　　 方法：以ox-LDL誘導(dǎo)大鼠主動(dòng)脈VSMC體外增殖模型，利用細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)MTT法檢測(cè)VSMC增殖程度。生化法測(cè)定細(xì)胞培

8、養(yǎng)液中丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）含量和超氧化物歧化酶（SOD）、一氧化氮合酶（NOS）活性的變化。應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)c-myc，MCP-1 mRNA的表達(dá)。觀察不同濃度PSP對(duì)上述指標(biāo)的影響。
　　 結(jié)果：（1） MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ox-LDL可誘導(dǎo)VSMC增殖，與空白對(duì)照組相比，差異有顯著性（P<0.01），給予不同濃度的PSP后，低、中、高濃度的PSP組對(duì)平滑肌細(xì)胞增殖抑制率分別為（10.47±1.07）％，

9、（26.75±2.36）％，（47.68±2.53）％，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴(lài)性。說(shuō)明PSP對(duì)平滑肌細(xì)胞的增殖具有抑制作用。
　　 （2）脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA含量的變化：ox-LDL可明顯增加VSMC中MDA含量，空白對(duì)照組MDA含量為14.52±1.23 nmol/ml，ox-LDL組MDA含量為26.38±2.59nmol/ml，與空白對(duì)照組相比有顯著性差異（P<0.01）。不同濃度的PSP組MDA含量分別為24.19±2.6

10、3、21.97±1.49、19.85±1.78 nmol/ml，與ox-LDL組相比有顯著性差異，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴(lài)性。
　　 （3） SOD活性的變化：ox-LDL可明顯降低細(xì)胞的SOD活力，與空白對(duì)照組相比差異有顯著性（P<0.01）?？瞻讓?duì)照組SOD活力為51.67±5.28 U/ml，ox-LDL組SOD活力為35.39±3.15 U/ml，不同濃度的PSP作用后其SOD活力分別為37.16±2.97、40.64±4.

11、76、46.73±5.47 U/ml，可見(jiàn)PSP能增強(qiáng)SOD的活性。
　　 （4） NO含量的變化：ox-LDL可抑制NO的合成和釋放，與空白對(duì)照組相比，ox-LDL組NO含量明顯降低?？瞻讓?duì)照組NO含量為78.65±6.76 nmol/ml，ox-LDL組NO含量為53.09±3.27 nmol/ml。低、中、高濃度PSP組NO含量分別為58.48±4.54、64.59±5.17、72.61±4.69 nmol/ml，與ox-

12、LDL組相比有顯著性差異（P<0.01）。說(shuō)明腳可以抑制ox-LDL的效應(yīng)，增加NO含量。
　　 （5） NOS活性的變化：空白對(duì)照組NOS活性為1.56±0.25U/ml，ox-LDL組NOS活性為1.18±0.11 U/ml，與空白對(duì)照組相比，ox-LDL組NOS活性明顯降低。低、中、高濃度PSP組NOS活性均比ox-LDL組有所提高，分別為1.29±0.15、1.40±0.18、1.45±0.20 U/ml，與ox-LDL

13、組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但各組之間無(wú)劑量依賴(lài)性。
　　 （6） VSMC中c-myc mRNA表達(dá)的變化：在空白對(duì)照組中，VSMC的c-myc mRNA呈現(xiàn)低表達(dá)，當(dāng)加入ox-LDL作用48 h，c-myc mRNA相對(duì)表達(dá)量，呈現(xiàn)明顯增高。分別加入不同劑量的PSP和ox-LDL共同孵育，PSP能明顯抑制ox-LDL誘導(dǎo)的c-myc mRNA表達(dá)，不同濃度PSP組c-myc的相對(duì)表達(dá)量分別為0.309±0.037

14、、0.286±0.044、0.245±0.038，PSP對(duì)c-myc mRNA表達(dá)的抑制作用隨劑量增加而有增強(qiáng)趨勢(shì)。
　　 （7） VSMC中MCP-1mRNA表達(dá)的變化：在空白對(duì)照組中，VSMC的MCP-1 mRNA呈現(xiàn)低表達(dá)，當(dāng)加入ox-LDL作用48h后，MCP-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量，呈現(xiàn)明顯增高。預(yù)先2h分別加入不同劑量的PSP和ox-LDL共同孵育，PSP能明顯抑制ox-LDL誘導(dǎo)的MCP-1 mRNA表達(dá)，各個(gè)濃度

15、的PSP組MCP-1的相對(duì)表達(dá)量分別為0.286±0.042、0.267±0.046、0.239±0.031，PSP對(duì)MCP-1 mRNA表達(dá)的抑制作用隨劑量增加而有增強(qiáng)趨勢(shì)。
　　 結(jié)論：（1） PSP對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的VSMC增殖有一定的抑制作用，對(duì)細(xì)胞的抑制率也隨藥物濃度增高明顯增高。（2）PSP具有抗脂質(zhì)過(guò)氧化和抗氧自由基損傷作用，減少脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA的生成，提高SOD的活性，這可能是其抑制ox-LDL誘導(dǎo)VSMC增