sPLA2-ⅡA對氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)的人主動脈平滑肌細胞MCP-1表達的影響及其機制.pdf

1、研究背景：
　　 動脈粥樣硬化是一種動脈壁慢性炎癥性疾病,其中含有apo-B脂蛋白顆粒在動脈壁的潴留和修飾是動脈粥樣硬化發(fā)病機制特征之一,而分泌型磷脂酶A2-ⅡA(secretory phospholipase A2 of groupⅡA,sPLA2-ⅡA)可水解磷酸卵磷脂的2位酯鍵,sPLA2-ⅡA修飾的LDL與蛋白聚糖的親和力增加,促進脂蛋白潴留,其水解后生成的游離脂肪酸和溶血磷脂,可產(chǎn)生重要的信號分子或進一步成為炎性介質(zhì),

2、從而改變內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、巨噬細胞的功能和特性,促動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。目前研究已表明血清升高的sPLA2-ⅡA是造成AS的獨立的危險因素,但是其致動脈粥樣硬化的作用機制不十分明確。
　　 目的：
　　 利用基因體外合成技術(shù),全基因合成人分泌型磷脂酶sPLA2-ⅡA基因片段,構(gòu)建含人sPLA2-ⅡA基因的慢病毒載體,感染人主動脈平滑肌細胞,并研究其在人主動脈平滑肌細胞中的過表達及致動脈粥樣硬化炎癥作用。
　　

3、 方法：
　　 根據(jù)Gene Bank中sPLA2-ⅡA的基因序列,全基因合成人sPLA2-ⅡA基因片段,構(gòu)建含sPLA2-ⅡA基因的慢病毒載體。體外培養(yǎng)人主動脈平滑肌細胞(HASMC),將慢病毒載體感染人主動脈平滑肌細胞,于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達,感染后72h加入OXLDL以及LY294002干預(yù),收集人主動脈平滑肌細胞,提取mRNA,逆轉(zhuǎn)錄為eDNA,Real-time PCR方法檢測sPLA2-ⅡA mRNA

4、表達水平與炎癥因子單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)的mRNA表達水平,ELISA法檢測單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)的蛋白表達水平。所有數(shù)據(jù)資料用Graphpadprism5.0統(tǒng)計學(xué)分析軟件行統(tǒng)計學(xué)處理。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義,P＜0.01為差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.擴增出人sPLA2-ⅡA基因片段,構(gòu)建含人sPLA2-ⅡA基因的慢病毒載體。測序表明構(gòu)建的sPlA2-Ⅱ A慢病毒準確

5、;
　　 2.體外培養(yǎng)人主動脈平滑肌細胞,細胞生長狀態(tài)良好,慢病毒感染入主動脈平滑肌細胞,熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)綠色熒光蛋白的表達,表明慢病毒感染真核細胞成功;
　　 3.感染sPLA2-ⅡA慢病毒的HASMC與ox-LDL共培養(yǎng),以及與ox-LDL+PI3K抑制劑LY294002共培養(yǎng),其中sPLA2-ⅡA慢病毒HASMC+OXLL組MCP一在1的mRNA及蛋白表達升高(P＜0.05),而含LY294002組MCP-1的