氧化型低密度脂蛋白通過上調(diào)腎素（前體）受體表達(dá)誘導(dǎo)人臍動脈平滑肌細(xì)胞增殖.pdf

1、動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是由多種細(xì)胞因子與血管壁細(xì)胞成分相互作用引起的慢性炎癥反應(yīng)。血管平滑肌細(xì)胞作為血管壁的主要結(jié)構(gòu)細(xì)胞參與了動脈粥樣硬化斑塊發(fā)生發(fā)展的所有階段。血管壁中膜中存在大量平滑肌細(xì)胞，當(dāng)他們遷移至血管壁內(nèi)膜，即可在眾多細(xì)胞因子的作用下大量增殖并發(fā)生表型轉(zhuǎn)變促使斑塊形成和發(fā)展。遷移到血管內(nèi)膜的平滑肌細(xì)胞表達(dá)多種細(xì)胞膜受體，這可能與多種細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路激活引起的細(xì)胞功能轉(zhuǎn)變有關(guān)。本實驗組前期試驗已證

2、實主動脈平滑肌細(xì)胞表面有腎素（前體）受體[(pro) rennin receptor，(P)RR]表達(dá)，但氧化低密度脂蛋白作用于平滑肌細(xì)胞(P) RR產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)尚未明確。
　　腎素（前體）受體，由于其能夠獨立于腎素—血管緊張素—醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)，發(fā)揮靶器官損傷的作用，自2002年被發(fā)現(xiàn)以來一直受到廣泛關(guān)注。研究揭示(P)RR能夠獨立于腎素前體及腎

3、素—血管緊張素—醛固酮系統(tǒng)(RAAS)激活促分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-ativated protein kinase，MAPK)信號通路并介導(dǎo)平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)變。本課題組前期主要圍繞(P) RR獨立于血管緊張素Ⅱ及其受體在不同致動脈粥樣硬化因素刺激下介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞及腎系膜細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活進(jìn)行研究。已有實驗證實血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)表面有(P)RR表達(dá)。但對其下

4、游信號通路及對細(xì)胞功能轉(zhuǎn)變的影響尚未明確，本實驗將就此進(jìn)行深入探討。
　　氧化型低密度脂蛋(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)作為致動脈粥樣硬化最重要的危險因素之一，在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的各個階段均起著十分重要的作用。有明確數(shù)據(jù)研究顯示急性冠狀動脈綜合征患者血漿中氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)水平顯著高于正常冠脈和穩(wěn)定型心絞痛人群。已有大量證據(jù)表明ox-LDL能夠誘導(dǎo)單核細(xì)胞遷入

5、內(nèi)皮下，增殖形成泡沫細(xì)胞。脂質(zhì)，尤其是ox-LDL以被證實有明確的促細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變作用。我們課題組前期試驗已經(jīng)證明了ox-LDL與(P)RR受體表達(dá)上調(diào)有關(guān)。但ox-LDL上調(diào)(P) RR表達(dá)引起的平滑肌細(xì)胞功能轉(zhuǎn)變及其分子機(jī)制尚未明確。
　　本研究將以人臍動脈平滑肌細(xì)胞(human umbilical artery smoothmuscle cells，HUASMCs)作為研究對象，觀察氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)對其腎素（

6、前體）受體表達(dá)的影響，并探究腎素（前體）受體表達(dá)上調(diào)對人臍動脈平滑肌細(xì)胞增殖的影響，從而更進(jìn)一步的探究腎素（前體）受體的致動脈粥樣硬化作用。
　　方法
　　以差速貼壁法體外培養(yǎng)純化原代人臍動脈平滑肌細(xì)胞(HUASMCs)。通過免疫組化法檢測平滑肌細(xì)胞表面α-SM-actin，鑒定細(xì)胞種類。在HUASMCs中以siRNA干擾(P) RR表達(dá)，分別以實時定量PCR及western blot方法檢測干擾24、48、72小時后(P)

7、 RR的mRNA和蛋白表達(dá)，以確定最佳干擾時間。予纈沙坦(10-5M)和PD123319(10-5M)分別阻斷HUASMCs表面血管緊張素Ⅱ受體AT1、AT2。以ox-LDL(50μ g/ml)作用于HUASMC0、10、20、30、45、60分鐘后分別收取蛋白，以western blot檢測(P) RR表達(dá)，以確定ox-LDL刺激HUASMCs使其(P) RR表達(dá)最強(qiáng)所需時間。予纈沙坦(10-5M)和PD123319(10-5M)分別

8、阻斷HUASMCs血管緊張素Ⅱ受體AT1、AT2。分別以ox-LDL0、10、25、50、100(μg/ ml)作用于HUASMCs，20分鐘后分別收取蛋白，以western blot檢測(P) RR表達(dá)，以確定ox-LDL刺激PRR表達(dá)最強(qiáng)所需濃度。對平滑肌細(xì)胞以預(yù)實驗中確定的最佳濃度、最佳時間，按照ox-LDL, ox-LDL+Valsartan+PD123319、ox-LDL+siRNA+ Valsartan+PD123319,

9、ox-LDL+scrambleRNA+ Valsartan+PD123319、 siRNA+Valsartan+PD123319、空白組分別進(jìn)行干預(yù)處理。收取蛋白以westernblot檢測P38、p-P38表達(dá)。予SB203580(25μ M)阻斷P38信號通路，分別收取空白組、SB203580組、ox-LDL組、SB203580組干預(yù)后蛋白，以westernblot觀察SB203580對ox-LDL引起的p38蛋白磷酸化的影響。予S

10、B203580(25μ M)阻斷P38信號通路，按空白組、SB203580+ox-LDL組、ox-LDL組、SB203580組分別以SB203580干預(yù)30分鐘后加ox-LDL50μ g/ml于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱孵育0h、24h、48h、72h、96h后以WST-8試劑盒檢測細(xì)胞增殖率。
　　結(jié)果:
　　1.原代培養(yǎng)人臍動脈平滑肌細(xì)胞免疫熒光檢測α-SM-actin相關(guān)抗原陽性。
　　2.實時定量PCR，west

11、ern blot檢測證實腎素（前體）受體表達(dá)于人臍動脈平滑肌細(xì)胞。與對照組相比，以小RNA干擾下調(diào)腎素（前體）受體表達(dá)后，其mRNA表達(dá)于48小時下調(diào)最明顯(P＜0.05)，蛋白表達(dá)于72小時達(dá)最大抑制率(P＜0.05)。
　　3.ox-LDL可以呈時間、濃度依賴性上調(diào)腎素（前體）受體表達(dá)，分別以ox-LDL0、10、25、50、100ug/ml處理HUASMCs20min，腎素（前體）受體表達(dá)逐漸增強(qiáng)，在50μ g/ml表達(dá)最強(qiáng)

12、(P＜0.05)，以ox-LDL(50ug/ml)處理人臍動脈平滑肌細(xì)胞0min、10min、20min、30min、45min、60min，腎素（前體）受體蛋白表達(dá)隨時間逐漸升高，于20min達(dá)峰值(P＜0.05)，至60min無明顯改變，故選擇50μg/ml干擾20min為后續(xù)實驗最適條件。
　　4.ox-LDL刺激P38信號通路磷酸化(P＜0.05)，以siRNA特異性阻滯PRR表達(dá)可抑制ox-LDL引起的P38蛋白磷酸化(

13、P＜0.05)。
　　5.與對照組相比，氧化型低密度脂蛋白能夠明顯增加平滑肌細(xì)胞的增殖(P＜0.05)，P38信號通道阻斷劑SB203580能夠明顯抑制該增殖效應(yīng)(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.人臍動脈平滑肌細(xì)胞表達(dá)豐富的(P) RR。
　　2.Ox-LDL在人臍動脈平滑肌細(xì)胞中可以不依賴于AngⅡ誘導(dǎo)(P) RR過表達(dá)，并呈現(xiàn)一定濃度-時間依賴性。
　　3.Ox-LDL能夠通過上調(diào)(P) RR表達(dá)