轉(zhuǎn)化生長因子-β1誘導(dǎo)人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的作用及機(jī)制研究.pdf

1、胸主動(dòng)脈夾層(Thoracic Aortic Dissection，TAD)指多種原因造成的胸主動(dòng)脈內(nèi)膜破裂，血液經(jīng)破口進(jìn)入動(dòng)脈壁中層與外層間隙內(nèi)，并形成一個(gè)假腔，是一種嚴(yán)重危及生命的主動(dòng)脈疾病。該病發(fā)病兇險(xiǎn)，死亡率高，但目前發(fā)病機(jī)制仍不完全清楚。
　　血管平滑肌細(xì)胞(Vascular Smooth Muscle Cell，VSMC)是胸主動(dòng)脈中膜的主要成份，存在收縮型和合成型兩種表型。前者分化程度較高，增殖、遷移能力較弱;其特有

2、的標(biāo)志物為α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(Smooth Muscleα-Actin，α-SMA)、平滑肌22α(Smooth Muscle22α，SM22α)等。而后者分化程度較低，增殖、遷移能力較強(qiáng)，其標(biāo)志物是骨橋蛋白（Osteopontin，OPN）、表皮生長因子Epiregulin等。當(dāng)VSMC向合成型轉(zhuǎn)化后，合成型標(biāo)志物表達(dá)水平上調(diào);而向收縮型轉(zhuǎn)化時(shí)，收縮型標(biāo)志物表達(dá)水平上調(diào)。正常情況下，VSMC以收縮型存在利于對(duì)抗血管張力并維持血管壁穩(wěn)態(tài)

3、。然而，當(dāng)VSMC受不同病理和生理刺激后會(huì)發(fā)生表型改變，即由收縮型向合成型轉(zhuǎn)變，開始增殖、遷移并合成過多的細(xì)胞外基質(zhì)，從而導(dǎo)致主動(dòng)脈血管壁組織的病理生理改變。研究發(fā)現(xiàn)，TAD中VSMC主要以合成型的形式存在，可使胸主動(dòng)脈壁變得易于破裂，提示VSMC由收縮型向合成型的表型轉(zhuǎn)化是導(dǎo)致TAD發(fā)生的重要因素。進(jìn)一步的研究表明，轉(zhuǎn)化生長因子-β(Transforming growth factor-β，TGF-β)可以誘導(dǎo)VSMC增殖及遷移，并且

4、促使靜止的收縮型VSMC轉(zhuǎn)化成活化的合成型VSMC進(jìn)而參與血管重構(gòu)，其中TGF-β1是導(dǎo)致VSMC發(fā)生表型轉(zhuǎn)化的重要因子。多種信號(hào)通路參與了這一過程，即其通過激活下游信號(hào)通路發(fā)揮作用。這些信號(hào)通路有兩大類:1、依賴Smad蛋白的經(jīng)典信號(hào)通路:TGF-β與TGF-β受體-Ⅱ結(jié)合，從而活化TGF-β受體-Ⅰ，繼而使Smad2和Smad3蛋白磷酸化，并與Smad4形成一種Smad2/3-Smad4復(fù)合體，通過調(diào)整胞核轉(zhuǎn)錄因子的位置而激活TGF

5、-β目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄，從而影響細(xì)胞增殖、生長、發(fā)育和死亡;2、非依賴Smad的信號(hào)通路，如磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（Phosphoinositide-3-kinase/Protein Kinase B，PI3K/PKB或PI3K/AKT）、p38、ERK等。PI3K/AKT等非依賴Smad信號(hào)近年來日漸被重視，這些信號(hào)通路可能獨(dú)立或者與依賴Smad蛋白的信號(hào)通路聯(lián)合發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。
　　本研究通過對(duì)細(xì)胞表型標(biāo)志性蛋白的檢測(cè)及骨

6、架形態(tài)、增殖、遷移能力的分析，判斷VSMC處于哪種表型，是否發(fā)生了表型轉(zhuǎn)化，再對(duì)TGF-β1調(diào)節(jié)的PI3K/AKT誘導(dǎo)VSMC表型轉(zhuǎn)化的下游信號(hào)通路進(jìn)行探討，可闡明引起VSMC表型轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制，其結(jié)果將為探討TAD發(fā)病機(jī)制拓寬視野，有助于手術(shù)方式和時(shí)機(jī)的選擇，并可為防治TAD的內(nèi)科藥物治療提供可能的分子新靶點(diǎn)，對(duì)新藥物的研究進(jìn)行新探索，并為夾層患者的進(jìn)一步基因治療提供理論依據(jù)。
　　第一部分:
　　目的:
　　探討不

7、同濃度轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)對(duì)人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HA-VSMCs)增殖及遷移的影響。
　　方法:
　　體外培養(yǎng)人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，用不同濃度(0、0.05、0.1、0.5、1、2、5、10ng/ml)的重組人TGF-β1進(jìn)行干預(yù)，分別在干預(yù)后第0、6、12、24、36h5個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行CCK-8試驗(yàn)或24h后進(jìn)行Transwell遷移試驗(yàn)，觀察細(xì)胞增殖及遷移情況。
　　結(jié)果:
　　當(dāng)TGF-β1濃

8、度小于5ng/ml時(shí)，隨著刺激濃度增加，人主動(dòng)脈VSMCs增殖水平逐漸升高，而大于5ng/ml時(shí)，細(xì)胞增殖水平降低。不同濃度TGF-β1(0、0.05、0.1、0.5、1、2、5、10ng/ml)干預(yù)細(xì)胞，隨著作用時(shí)間延長，細(xì)胞增殖水平逐漸升高，在24h時(shí)達(dá)到高峰，之后逐漸降低。其中，TGF-β1濃度為5ng/ml且培養(yǎng)時(shí)間為24h時(shí)細(xì)胞增殖水平最高（OD值:0.843±0.016）(P＜0.01)。當(dāng)TGF-β1濃度小于等于5ng/m

9、l(0、0.05、0.1、0.5、1、2、5ng/ml)且作用時(shí)間為24h時(shí)，隨著TGF-β1濃度增加，人主動(dòng)脈VSMCs遷移水平不斷升高，其中以TGF-β1濃度為5ng/ml時(shí)細(xì)胞遷移水平最高（遷移細(xì)胞數(shù):84.667±0.577）;而大于5ng/ml時(shí)，細(xì)胞遷移水平降低（遷移細(xì)胞數(shù):69.667±1.528）(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　5ng/ml的TGF-β1作用24h更能刺激人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞發(fā)生增殖及遷移。

10、
　　第二部分:
　　實(shí)驗(yàn)一:
　　目的:
　　探討PI3K/AKT信號(hào)通路在轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)誘導(dǎo)人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化中的作用。
　　方法:
　　體外培養(yǎng)的人主動(dòng)脈VSMC被分成5組:①空白對(duì)照組;②TGF-β1組;③TGF-β1抑制劑組;④AKT抑制劑組;⑤雙抑制劑組;分別進(jìn)行不同預(yù)處理，24h后通過CCK-8、Transwell試驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞增殖、遷移能力，考馬斯亮藍(lán)染色

11、檢測(cè)其細(xì)胞骨架形態(tài);Western Blot檢測(cè)各組細(xì)胞PI3K、AKT、P-PI3K、P-AKT、ID2、SM22α、α-SMA、OPN的表達(dá)水平;qRT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞PI3K、AKT、ID2、SM22α、α-SMA、OPN的mRNA含量。
　　結(jié)果:
　　TGF-β1組VSMC增殖與遷移顯著增多，雙抑制劑組細(xì)胞增殖與遷移顯著降低。TGF-β1刺激后可使肥胖型VSMC細(xì)胞較多，且呈峰谷狀生長;而其余四組細(xì)胞主要保持細(xì)

12、長梭形，其中以雙抑制劑組最為明顯。TGF-β1可促進(jìn)PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、ID2、OPN的蛋白表達(dá)，而抑制α-SMA、SM22α蛋白表達(dá)，雙抑制劑組與TGF-β1組結(jié)果相反。TGF-β1刺激后PI3K、AKT、ID2、OPN mRNA含量最高，而α-SMA、SM22α mRNA含量最低，雙抑制劑組與TGF-β1組結(jié)果相反。
　　結(jié)論:
　　PI3K/AKT/ID2途徑參與了TGF-β1介導(dǎo)的人主動(dòng)脈平滑

13、肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化過程，TGF-β1、AKT特異性抑制劑(SB525334，MK2206-2HCL)及雙抑制劑(SB525334+MK2206-2HCL)均可抑制這一表型轉(zhuǎn)化過程，但雙抑制劑較單一抑制劑抑制更能有效抑制其表型轉(zhuǎn)化。以雙抑制劑為研究方向，望能為以表型轉(zhuǎn)化為病理基礎(chǔ)的TAD的防治提供新思路。
　　實(shí)驗(yàn)二:
　　目的:
　　觀察DNA結(jié)合抑制因子2(ID2)在人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化中的作用。
　　方法:

14、
　　首先設(shè)計(jì)并合成靶向ID2的siRNA并轉(zhuǎn)染人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HA-VSMCs)，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)篩選出沉默效率最高的siRNA序列。生物合成人ID2序列，將其插入pIRES2-ZsGREEN1質(zhì)粒載體，構(gòu)建過表達(dá)ID2重組質(zhì)粒載體pIRES2-ZsGREEN1-ID2并鑒定。細(xì)胞培養(yǎng)后分5組:正常組、空質(zhì)粒對(duì)照組、ID2過表達(dá)組、siRNA對(duì)照組、ID2 siRNA組，正常組不導(dǎo)入質(zhì)粒，空質(zhì)粒對(duì)照

15、組脂質(zhì)體介導(dǎo)法導(dǎo)入pIRES2-ZsGREEN1質(zhì)粒，ID2過表達(dá)組導(dǎo)入pIRES2-ZsGREEN1-ID2質(zhì)粒，siRNA對(duì)照組直接導(dǎo)入非同源siRNA(siRNA NC)、ID2 siRNA組導(dǎo)入ID2 siRNA，qRT-PCR及Western Blot檢測(cè)其ID2、平滑肌22α(SM22α)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、骨橋蛋白(OPN) mRNA及蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　成功設(shè)計(jì)具有較高沉默活性的ID2

16、 siRNA，并成功構(gòu)建了pIRES2-ZsGREEN1-ID2過表達(dá)重組質(zhì)粒;與正常組、空質(zhì)粒對(duì)照組、siRNA對(duì)照組相比，ID2過表達(dá)組的ID2、OPN mRNA和蛋白表達(dá)明顯升高[ID2mRNA:2.637±0.053; OPN mRNA:1.692±0.086; ID2:0.580±0.017;OPN:0.460±0.015]，SM22α、α-SMA mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低[SM22αmRNA:0.367±0.048;α-S

17、MA mRNA:0.428±0.031; SM22α:0.100±0.004;α-SMA:0.063±0.010](P＜0.01)，而ID2 siRNA組ID2、OPN mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低[ID2 mRNA:0.322±0.046; OPN mRNA:0.250±0.056; ID2:0.061±0.007;OPN:0.066±0.006]，SM22α、α-SMA mRNA和蛋白表達(dá)顯著升高[SM22αmRNA:1.827±0.