降鈣素基因相關(guān)肽對(duì)大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖及表型轉(zhuǎn)化的影響.pdf

1、目的：
　　 根據(jù)引起病理改變的兩種主要病因脂質(zhì)代謝異常和內(nèi)皮損傷建立兩種血管平滑肌細(xì)胞增殖的器官模型,通過(guò)降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-relatedpeptide,CGRP)作用于此兩種平滑肌增殖器官模型,用蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining,H-E染色)和免疫細(xì)胞化學(xué)方法觀察平滑肌細(xì)胞增殖變化,檢驗(yàn)評(píng)估所建立器官增殖模型效果;實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(revers

2、e transcription-polymerase chain raction,RT-PCR)法檢測(cè)與血管平滑肌細(xì)胞增殖和表型轉(zhuǎn)化相關(guān)的基因:高血壓相關(guān)基因(hypertension related gene,HRG-1)和平滑肌220(smooth muscle22 alpha,SM220)的表達(dá),闡明CGRP對(duì)血管平滑肌增殖以及表型轉(zhuǎn)化是否有影響,并比較CGRP對(duì)兩種不同誘導(dǎo)因素引起增殖的影響作用的區(qū)別。
　　 方法：

3、r>　　 取150g～200g健康SD大鼠的主動(dòng)脈,按照器官培養(yǎng)方法行體外培養(yǎng)血管,分組如下,A組:內(nèi)膜損傷組;B組:代謝異常組:C正常對(duì)照組(不培養(yǎng))。A組用表面粗糙的竹簽穿過(guò)血管,來(lái)回一次,再分為Al組(添加CGRP)和A2組(不添加CGRP);B組在培養(yǎng)液中加入氧化性低密度脂蛋白(oxidized lowdensity lipoprotein,OX-LDL),再分為BI組(添加CGRP)和B2組(不添加CGRP);C組即用即取。

4、每組2條血管,A組、B組在含20％胎牛血清DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)9天,在取出前72小時(shí)用5-Brdu(8×10-4mol/L)標(biāo)記,培養(yǎng)結(jié)束后用HE染色和抗5-Brdu免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀察細(xì)胞增殖,檢驗(yàn)評(píng)估細(xì)胞增殖器官模型的建立情況,并觀察CGRP對(duì)血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth musclecell,VSMC)增殖的影響作用。
　　 按照上述探索好的器官增殖模型建立方法,重新體外培養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈(分組方法及條件完全

5、同上,僅免去5-Brdu標(biāo)記步驟),每組4條血管,于培養(yǎng)的第9天取出血管用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)血管平滑肌細(xì)胞增殖相關(guān)基因HRG-1和表型轉(zhuǎn)化相關(guān)基因SM22α的表達(dá)水平,統(tǒng)計(jì)分析加CGRP組和未加CGRP組基因表達(dá)水平的差異,并比較內(nèi)膜損傷和脂質(zhì)異常誘導(dǎo)的增殖對(duì)CGRP敏感性差異。
　　 結(jié)果：
　　 HE染色可見(jiàn),經(jīng)過(guò)內(nèi)膜損傷和脂質(zhì)異常處理的大鼠主動(dòng)脈血管,體外培養(yǎng)9天后有增生斑塊,但是加入CGRP的組增生斑塊明顯

6、較未加入CGRP的組減少,用免疫組織化學(xué)染色進(jìn)一步證實(shí)未加CGRP組的血管中膜可見(jiàn)大量被標(biāo)記的增生平滑肌細(xì)胞;而加CGRP作用組則標(biāo)記到的增殖細(xì)胞明顯減少:A1組較A2組增殖明顯減少;B1組較B2組增殖明顯減少;A1組B1組比較無(wú)明顯差別。
　　 RT-PCR結(jié)果顯示,加CGRP的A1、B1組分別較未加CGRP的A2、B2組HRG-1和SM22a表達(dá)明顯增高。A1、B1組之間表達(dá)水平無(wú)明顯差別。
　　 結(jié)論：