香煙提取物與轉化生長因子-β1對慢阻肺氣道平滑肌細胞的影響研究.pdf

1、慢性阻塞性肺疾病(COPD),又稱“慢阻肺”是一種以呼吸道氣流阻塞為特點的呼吸道疾病,病情常呈進行性發(fā)展[1]。持續(xù)且大量增長的COPD發(fā)病率和死亡率已造成了沉重的社會負擔和經(jīng)濟負擔。COPD患者肺部的主要病癥是呼吸道持續(xù)性炎癥和不可逆的氣流阻塞[1]。小氣道氣道重塑被認為是造成氣道氣流受限的重要原因。小氣道重塑表現(xiàn)為粘膜增厚,基底膜增厚以及細胞外基質蛋白過度沉積,在重癥 COPD患者中還觀察到氣道平滑肌(ASM)組織增生。細胞外基質(

2、ECM)是一個由生物大分子和蛋白水解酶相互作用而構成的復雜的網(wǎng)絡結構,為細胞與細胞,細胞與基質之間相互作用提供平臺。在肺部,細胞外基質的組成成分影響著動態(tài)網(wǎng)絡的結構和功能。通過組織染色等研究發(fā)現(xiàn),COPD患者氣道細胞外基質的成分明顯發(fā)生改變。目前認為,吸煙是導致COPD發(fā)生發(fā)展的主要原因,許多研究認為COPD的典型發(fā)病原因是因為吸煙引起慢性炎癥從而致使組織破壞,然而有研究表明, COPD患者氣道重塑可獨立于氣道炎癥而產(chǎn)生。研究顯示,CO

3、PD患者的成纖維細胞在受到香煙提取物(CSE)的刺激之后可提高成粘連蛋白(Fibronectin, FN)和基底膜聚糖(Perlecan)的沉積量,而降低核心蛋白聚糖(Decorin)和雙糖鏈蛋白多糖(Biglycan)等蛋白聚糖的沉積。然而目前關于香煙對COPD氣道平滑肌細胞影響的研究卻較少。轉化生長因子-β1(Transforming growth factor, TGF-β1)是一種促纖維化細胞因子,常常在急性或者慢性肺部疾病中表

4、達增高,如COPD、哮喘和肺纖維化等。TGF-β1被認為在組織纖維化的病理過程中扮演著重要的作用,可刺激多種細胞外基質蛋白的表達與分泌如纖連蛋白、基底膜蛋白和多種膠原蛋白?？坩樀鞍?1(Fibulin-1, FBLN-1)是一種分泌型糖蛋白,它與細胞外基質網(wǎng)絡的形成和再建密切相關,與多種細胞外基質蛋白相互作用如纖連蛋白、巢蛋白以及層黏粘蛋白等。然而目前對于FBLN-1在氣道纖維化的病理機制中所起到的作用還不清楚。
　　本研究假設來

5、自COPD患者與非COPD患者的氣道平滑肌細胞在CSE或TGF-β1單獨作用下,其細胞外基質基因表達趨勢會明顯不同,并且氣道平滑肌細胞會對CSE和 TGF-β1這兩種刺激物產(chǎn)生明顯不同的細胞外基質基因表達趨勢。進一步,我們假設兩個實驗組的平滑肌細胞對氣道重塑相關蛋白的表達和釋放也不相同,并且對CSE刺激產(chǎn)生的細胞行為的反應也不相同。最后我們假設 TGF-β1可促進 FBLN-1在細胞外基質中的沉積,并且在COPD氣道平滑肌細胞中的表達量

6、更高。為檢驗以上假設,我們采用導致COPD產(chǎn)生的高危因素-香煙提取物(CSE),以及氣道纖維化誘導因子 TGF-β1作為刺激物,對體外培養(yǎng)的來自 COPD患者與非 COPD患者的氣道平滑肌細胞進行了刺激。繼而,檢測與觀察了相應的氣道平滑肌細胞細胞外基質蛋白基因和細胞粘附相關基因的表達水平。在此基礎上,進一步篩選并檢測了部分膠原蛋白和基質金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase, MMP)的表達情況,并檢測了CSE對氣

7、道平滑肌細胞粘附和修復功能的影響。最后,我們深入探究了FBLN-1在氣道纖維化中可能起到的作用。
　　本研究表明：⑴CSE比TGF-β1上調(diào)更多細胞外基質蛋白基因和與細胞粘附相關的基因,特別是在COPD組尤為明顯。使用濃度為5％的CSE或 TGF-β1刺激氣道平滑肌細胞之后,膠原蛋白類基因在COPD組中上調(diào)數(shù)量高于非COPD組;而MMP類基因在非COPD組中上調(diào)數(shù)量高于COPD組。10％的CSE使COPD組氣道平滑肌細胞比非COP

8、D組上調(diào)更多MMP基因。TGF-β1比5％的CSE上調(diào)更高倍數(shù)的COPD膠原蛋白基因;而5％的CSE比 TGF-β1上調(diào)更高倍數(shù)和數(shù)量的非 COPD的MMP基因。⑵MMP在培養(yǎng)基上清液中的總表達檢測結果顯示,基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)在氣道平滑肌細胞中的表達量相對于基質金屬蛋白酶-1、-3、-10(MMP-1,-3,-10)更高,但是 CSE和 TGF-β1對其表達量沒有影響。MMP-3和MMP-10的表達趨勢類似,高濃度的CSE

9、(10％)可增高氣道平滑肌細胞中MMP-3和MMP-10的表達量,而TGF-β1僅增高COPD氣道平滑肌細胞中MMP-3和MMP-10的表達量。CSE而非TGF-β1增高了MMP-1的表達量,并且兩個實驗組細胞受CSE刺激之后其MMP-1表達量有顯著性差異。⑶CSE或TGF-β1的刺激僅僅增高了COPD氣道平滑肌細胞的膠原蛋白-8α1(Collagen VIIIα1, COL8A1)在細胞外基質中的沉積。氣道組織染色實驗進一步證實 CO

10、PD患者氣道內(nèi) COL8A1比非 COPD患者氣道內(nèi) COL8A1的表達量更高。⑷CSE僅僅降低 COPD氣道平滑肌細胞的粘附和傷口修復能力,對非COPD氣道平滑肌細胞沒有影響,然而 TGF-β1促進 COPD氣道平滑肌細胞的粘附能力。⑸TGF-β1降低氣道平滑肌細胞分泌可溶型 FBLN-1而增高細胞外基質中沉積的FBLN-1。TGF-β1可促進外源性FBLN-1沉積于細胞外基質之中。
　　本研究揭示了COL8A1在COPD與非C

11、OPD氣道平滑肌組織中的差異和在氣道平滑肌細胞中的表達差異,從而為進一步探究COL8A1在氣道重塑中的作用提供了理論依據(jù)。本課題的研究也顯示 CSE可誘導多種MMP基因表達增高,特別是MMP-1(膠原蛋白酶)在COPD氣道平滑肌細胞中表達顯著高于非 COPD氣道平滑肌細胞,此實驗結果提示 MMP在肺泡組織降解中起到重要作用。在TGF-β1的誘導下,可溶型 FBLN-1向細胞外基質FBLN-1轉化,為我們理解細胞外基質沉積在氣道纖維化中的