香煙提取物通過周期蛋白D1促進(jìn)支氣管哮喘大鼠氣道平滑肌細(xì)胞增殖.pdf

1、目的：
　　 支氣管哮喘（簡稱哮喘）是當(dāng)今世界最常見的慢性疾病之一，目前國、內(nèi)外的研究認(rèn)為，哮喘的本質(zhì)是氣道慢性炎癥，并在此基礎(chǔ)上出現(xiàn)氣道高反應(yīng)性和氣道重構(gòu)。而氣道平滑肌的增殖在哮喘氣道重構(gòu)中起著重要作用，是不可逆性氣流阻塞、持續(xù)氣道高反應(yīng)性的重要病理基礎(chǔ)。但是，哮喘氣道平滑肌增殖的調(diào)控機(jī)制目前尚不十分清楚。
　　 吸煙是影響哮喘發(fā)生、發(fā)展的重要危險因素，它可以增加哮喘發(fā)生頻率和癥狀嚴(yán)重程度。目前研究發(fā)現(xiàn)，吸煙可以降低皮

2、質(zhì)激素對哮喘患者的治療效果。香煙煙霧中含有6000多種化學(xué)物質(zhì)，其中多種物質(zhì)有毒。香煙煙霧能增加卵白蛋白致敏豚鼠氣道急性變應(yīng)性炎癥。我們以往的研究發(fā)現(xiàn)，香煙提取物（CSE）可以促進(jìn)哮喘大鼠氣道平滑肌細(xì)胞（ASMCs）的增殖，但其具體機(jī)制尚未闡明。
　　 國內(nèi)外研究表明,細(xì)胞分裂及細(xì)胞數(shù)量的增加要通過細(xì)胞周期，在細(xì)胞周期中必須有細(xì)胞周期蛋白的參與，這種蛋白對細(xì)胞周期起調(diào)控作用。而D1類細(xì)胞周期蛋白（cyclinD1）是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期

3、G1期向S期轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵因子，參與眾多細(xì)胞周期的調(diào)控。CSE是否通過cyclinD1參與調(diào)控ASMCs增殖，目前相關(guān)研究報道尚少見。
　　 本實驗通過建立哮喘大鼠模型，體外培養(yǎng)ASMCs，在細(xì)胞水平研究CSE對ASMCs的增殖作用、對cyclinD1表達(dá)的影響以及PKC-cyclinD1信號通路是否參與CSE促ASMCs的增殖過程，探討CSE促進(jìn)ASMCs增殖的可能機(jī)制。為進(jìn)一步深入了解哮喘的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的治療方法提供理論依

4、據(jù)。
　　 方法：
　　 1建立大鼠哮喘模型，原代培養(yǎng)大鼠ASMCs。用CSE和細(xì)胞周期蛋白依賴激酶-4抑制劑GW8510干預(yù)哮喘大鼠ASMCs，用四甲基偶氮唑鹽（MTT）法、流式細(xì)胞術(shù)及增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測ASMCs增殖；用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和蛋白質(zhì)印跡（Western blot）檢測細(xì)胞周期蛋白D1(cyclinD1)的表達(dá)。研究CSE對ASMCs的增殖作用以及對cycli

5、nD1表達(dá)的影響。
　　 2建立大鼠哮喘模型，原代培養(yǎng)大鼠ASMCs。用CSE和cyclinD1反義表達(dá)質(zhì)粒干預(yù)哮喘大鼠ASMCs，用四甲基偶氮唑鹽（MTT）法、流式細(xì)胞術(shù)及增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測ASMCs增殖；用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和蛋白質(zhì)印跡（Western blot）檢測細(xì)胞周期蛋白D1(cyclinD1)的表達(dá)。研究CSE和cyclinD1反義表達(dá)質(zhì)粒對ASMCs增殖的干預(yù)作用。<

6、br>　　 3建立大鼠哮喘模型，原代培養(yǎng)大鼠ASMCs。用CSE和PKC激動劑PMA以及抑制劑Ro-31-8220干預(yù)哮喘大鼠ASMCs，用四甲基偶氮唑鹽（MTT）法、流式細(xì)胞術(shù)及增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測ASMCs增殖；用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和蛋白質(zhì)印跡（Western blot）檢測cyclinD1和PKC-α的表達(dá)。探討PKC-cyclinD1信號通路是否參與CSE促ASMCs的增殖。

7、　　 結(jié)果：
　　 1.與對照組ASMCs相比，CSE處理組G0/G1期細(xì)胞所占比例明顯減少，S+G2M期細(xì)胞所占比例明顯增高，吸光度A值、PCNA陽性表達(dá)率明顯增高。cyclinD1 mRNA和蛋白的表達(dá)明顯增加。哮喘組與對照組相比，G0/G1期細(xì)胞所占比例明顯減少，S+G2M期細(xì)胞所占比例明顯增高，吸光度A值、PCNA陽性表達(dá)率明顯增高。cyclinD1 mRNA和蛋白的表達(dá)明顯增加。經(jīng)GW8510干預(yù)后，哮喘組ASMCs

8、 G0/G1期細(xì)胞所占比例明顯增高，S+G2M期細(xì)胞所占比例明顯降低，吸光度A值、PCNA陽性表達(dá)率明顯降低。cyclinD1 mRNA和蛋白的表達(dá)明顯減少。
　　 2. 反義質(zhì)粒組與對照組相比，G0/G1期細(xì)胞所占比例明顯增高，S+G2M期細(xì)胞所占比例明顯降低，吸光度A值、PCNA陽性表達(dá)率明顯降低。cyclinD1 mRNA和蛋白的表達(dá)明顯減少。CSE組與CSE+反義質(zhì)粒組相比其G0/G1期細(xì)胞所占比例明顯減少，S+G2M期

9、細(xì)胞所占比例明顯增高，吸光度A值、PCNA陽性表達(dá)率明顯增高。cyclinD1 mRNA和蛋白的表達(dá)明顯增加。
　　 3.與CSE組相比，Ro-31-8220處理組G0/G1期細(xì)胞所占比例明顯增高，S+G2M期細(xì)胞所占比例明顯降低，吸光度A值、PCNA陽性表達(dá)率明顯降低。cyclinD1，PKC-αmRNA和蛋白的表達(dá)明顯減少。CSE+PMA組和CSE+PMA+反義質(zhì)粒組相比其G0/G1期G0/G1期細(xì)胞所占比例明顯減少，S+G

10、2M期細(xì)胞所占比例明顯增高，吸光度A值、PCNA陽性表達(dá)率明顯增高。cyclinD1，PKC-αmRNA和蛋白的表達(dá)明顯增加。
　　 結(jié)論：
　　 1. 哮喘大鼠ASMCs增殖活性明顯增強(qiáng)，CSE可以促進(jìn)哮喘大鼠ASMCs增殖，cyclinD及其亞型cyclinD1在哮喘大鼠ASMCs的增殖中發(fā)揮了重要的作用。
　　 2. cyclinD1反義表達(dá)質(zhì)?？梢砸种葡笫驛SMCs的增殖，即使再用CSE刺激，也不能明