AOPP對血管平滑肌細胞MCP-1表達及其信號通路的研究.pdf

1、研究背景 心血管疾病(Cardiovascular disease，CVD)是慢性腎功能衰竭(Chronic renalfailure，CRF)病人，尤其是終末期腎病病人(End-stage renal disease，ESRD)最常見的并發(fā)癥和最主要的死亡原因。透析治療技術(shù)的長足進步雖然顯著地減少了威脅終末期腎病患者急性事件的發(fā)生，但CRF病人并發(fā)心血管疾病而導(dǎo)致的死亡仍居高不下。長期透析病人死亡原因中，有50％系心血管事件所

2、引起，是普通人群CVD導(dǎo)致死亡的10～20倍，說明CVD是威脅依賴性透析病人長期生存的主要因素。雖然血脂和血糖代謝紊亂、高血壓等CVD危險因素在透析病人的發(fā)生率明顯高于普通人群，但仍然不能滿意解釋CRF病人CVD如此高的發(fā)病率和死亡率，提示尿毒癥毒素可能是其促發(fā)因素之一。研究表明，已有多種尿毒癥毒素與CVD有關(guān)，特別是新發(fā)現(xiàn)的尿毒癥毒素AOPP已證明與動脈粥樣硬化有明確關(guān)系，但其機制尚在研究中。進一步明確其機制，對防治這一常見并發(fā)癥具有

3、極大的臨床意義。 晚期氧化蛋白產(chǎn)物(Advanced oxidation protein products，AOPP)是Witko-Sarsat等于1996年首先報道的由尿毒癥血液透析患者血漿中分離出的含有雙酪氨酸的蛋白交聯(lián)產(chǎn)物，系因患者體內(nèi)過高的氧化應(yīng)激水平導(dǎo)致各種蛋白質(zhì)氧化損傷所形成的終末產(chǎn)物的總稱。AOPP隨著慢性腎功能衰竭及氧化應(yīng)激的進展，在患者的循環(huán)和組織中潴留，是一類新的尿毒癥毒素。AS患者血漿AOPP水平明顯高于正

4、常人。血液透析的CRF病人頸動脈內(nèi)膜厚度與血漿AOPP水平呈正相關(guān)。靜脈反復(fù)注射AOPP可加速飼喂高膽固醇飼料兔AS斑塊的形成。上述研究提示，AOPP可能參與了AS的形成，但其機制目前還不清楚。單核細胞黏附于血管壁并穿入內(nèi)皮下形成泡沫細胞是動脈粥樣硬化的早期病變，而平滑肌細胞增生、遷移形成平滑肌肌源性泡沫細胞是該病較晚期病變。大量研究表明單核細胞的趨化主要由單核細胞趨化蛋白-1(monocytechemoattractant prote

5、in-1，MCP-1)MCP-1來實現(xiàn)，多種物質(zhì)及細胞因子都可以誘導(dǎo)MCP-1的表達，而MCP-1也可在多種細胞尤其是構(gòu)成動脈粥樣硬化病變的三種主要細胞一單核細胞、內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞中表達。有報道，AOPP通過氧化應(yīng)激引起內(nèi)皮細胞損傷可能是其參與AS發(fā)生、發(fā)展的機制之一。然而，AOPP對血管平滑肌細胞的影響尚無報道。本研究采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和免疫印跡法(Western blotting)檢測探討AOPP是否通過對血

6、管平滑肌細胞單核細胞趨化蛋白-1表達的影響而參與了動脈粥樣硬化的晚期病變的可能機制。細胞外信號向細胞核轉(zhuǎn)導(dǎo)信息時，需要細胞內(nèi)信號分子的參與。絲裂素活化蛋白激酶(MAPK)級聯(lián)系統(tǒng)是細胞內(nèi)主要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，細胞運用這一系統(tǒng)將細胞外刺激信號傳遞到細胞核，介導(dǎo)細胞產(chǎn)生反應(yīng)。哺乳動物細胞MAPK通路主要有：ERK，JNK/SAPK，p38三條途徑及目前所知相對較少的ERK5等通路。有研究提示，p38信號通路很可能是各種致AS病變因素的共同通路

7、。本研究也對p38-MAPK信號傳導(dǎo)通路在AOPP誘導(dǎo)MCP-1表達過程中的地位和作用了進行研究，為阻斷這一途徑尋找理論依據(jù)。并在臨床觀察不同透析模式對清除AOPP的影響及大劑量維生素C預(yù)沖透析器對尿毒癥患者AOPP的影響，為探索臨床防治CRF并發(fā)癥尋找新方法。 結(jié)果 1、AOPP以時間和劑量依賴的方式刺激血管平滑肌細胞合成分泌MCP-1增多。Western blotting檢測結(jié)果顯示，AOPP刺激的鼠血管平滑肌細胞M

8、CP-1的表達呈濃度依賴性；400μmol/L AOPP刺激的MCP-1與陽性對照者的MCP-1在相同時間表達水平一致。AOPP-HSA 400μmol/L不能使VSMCs3對MCP-1的表達進一步升高。MCP-1蛋白質(zhì)濃度從干預(yù)后一直呈升高趨勢，24h仍維持較高水平，與12h組相比，差異無顯著性意義(說明12小時已經(jīng)達高峰)。 2、AOPP以時間和劑量依賴的方式刺激血管平滑肌細胞高表達MCP-1 mRNA。MCP-1mRNA在

9、未被干預(yù)的VSMCs中有表達，隨AOPP-HSA濃度逐步升高．MCP-1的表達水平也逐步升高，mRNA表達高峰在200μmol/L。干預(yù)1h時，MCP-1mRNA的表達較基礎(chǔ)狀態(tài)明顯上升，4h達高峰，在24h時完全停止。 3、為了證明A()PP作用的特異性，我們在Western blot和RT-PCR實驗中觀察了兩種不同的AOPP(AOPP-HSA，AOPP-BSA)和兩種非AOPP修飾的蛋白質(zhì)(HSA，BSA)對MCP-1合成

10、的影響，發(fā)現(xiàn)未經(jīng)AOPP修飾的HSA或BSA對平滑肌細胞合成MCP-1無刺激作用，且AOPP-HSA和AOPP-BSA作用之間無明顯差異，說明AOPP特異刺激平滑肌細胞合成釋放MCP-1，而不是蛋白質(zhì)本身的作用；為了排除可能存在的內(nèi)毒素對試驗的影響，我們觀察了內(nèi)毒素鰲合劑多粘菌素B(PMX-B)對AOPP刺激平滑肌細胞合成MCP-1作用的影響。結(jié)果顯示，加入PMXB后，AOPP3對MCP-1合成的刺激作用沒有消失或減弱，說明實驗結(jié)果沒有

11、受到內(nèi)毒素的干擾。 4、在刺激平滑肌細胞生成MCP-1的同時，AOPP以時間和劑量依賴的方式活化p38-MAPK信號途徑。p38通路的特異阻斷劑SB203580能夠阻斷AOPP對平滑肌細胞合成釋放MCP-1的促進作用，說明AOPP對平滑肌細胞合成MCP-1的刺激作用是經(jīng)由1938-MAPK途徑介導(dǎo)的。 5、尿毒癥病人(未行血液透析)的AOPP較正常對照組顯著升高，而經(jīng)過半年血液透析的病人其AOPP較未透析病人又明顯升高，

12、但透析前經(jīng)過大劑量維生素C預(yù)處理透析器后其AOPP明顯下降。差異有統(tǒng)計學(xué)意義。單次HD治療，其AOPP略有下降，半年后，AOPP水平明顯升高，HDF治療組則明顯下降；單次HP治療后，AOPP水平明顯下降，但半年后差異無顯著性意義。 結(jié)論 1、AOPP通過促進鼠平滑肌細胞MCP-1mRNA和蛋白表達參與了尿毒癥患者加速性動脈粥樣硬化的病變過程。 2、由于AOPP誘導(dǎo)的鼠血管平滑肌細胞MCP-1的表達經(jīng)P38MAPK