奧美沙坦抑制高糖誘導大鼠主動脈平滑肌細胞增殖和遷移的作用研究.pdf

1、【目的】研究奧美沙坦對高糖誘導VSMCs增殖、遷移的影響，并探討ACE2/Ang(1-7)/Mas通路在該效應中的作用。
　　【研究方法】
　　1.為了驗證高濃度葡萄糖誘導對大鼠主動脈平滑肌細胞（VSMCs）形態(tài)及生理特征的影響，選擇離體培養(yǎng)大鼠原代胸主動脈平滑肌細胞(VSMCs)作為實驗對象。采用第3-8代性狀穩(wěn)定的原代細胞進行實驗操作。原代細胞鑒定采用組織學鑒定和免疫熒光鑒定兩種方法。組織學鑒定大鼠原代胸主動脈平滑肌(V

2、SMCs)鏡下觀呈現長梭性，部分可呈星形。免疫熒光鑒定采用a-SMC作為檢測抗原，大鼠原代胸主動脈平滑肌(VSMCs)胞漿內可見呈肌絲樣條狀分布的熒光信號。
　　2.為了驗證高濃度葡萄糖誘導對于大鼠主動脈平滑肌細胞(VSMCs)的影響，以及驗證奧美沙坦對該影響是否有治療作用，實驗分為5個處理組。分別為正常糖組(NG)、甘露醇對照組(Man)、高糖組(HG)、奧美沙坦組(Olm)、抑制劑組(A779+Olm)。正常糖組采用5.5mM

3、(1g/L)的葡萄糖濃度DMEM，高糖組是在正常糖組的基礎上額外補充葡萄糖，使培養(yǎng)體系中葡萄糖終濃度達到25mM(4.5g/L)，以保證高糖組與正常糖組除了葡萄糖濃度相異之外，其他干預因素均相同。甘露醇組是在正常糖組的基礎上額外補充19.5mM的甘露醇，使培養(yǎng)體系的滲透壓與高糖組保持一致，以排除滲透壓差異可能造成的影響。奧美沙坦組是在高糖組培養(yǎng)體系的基礎上加入奧美沙坦。A779+Olm組先于A779預先處理細胞30min，使細胞初步達到

4、受體抑制狀態(tài)，然后加入含A779和奧美沙坦的高糖培養(yǎng)體系，以探索ACE2/Ang（1-7）/MAS軸是否參與奧美沙坦對于高糖誘導細胞的作用?？紤]到細胞代謝對糖分的消耗，所有培養(yǎng)體系均每24h更新一次。
　　3.為了驗證高濃度葡萄糖誘導對于大鼠主動脈平滑肌細胞(VSMCs)的增殖影響。對細胞進行24h去血清預處理后，按預設分組處理細胞72h，處理結束后，采用MTT法檢測不同組細胞密度，從來評估細胞的增殖效益。
　　4.為了驗證

5、高濃度葡萄糖誘導對于大鼠主動脈平滑肌細胞(VSMCs)細胞周期影響。對細胞進行24h去血清預處理后，按預設分組處理細胞72h，處理結束后，采用PI單染法，流式細胞術檢測細胞周期改變。
　　5.為了驗證高濃度葡萄糖誘導對于大鼠主動脈平滑肌細胞(VSMCs)細胞水平遷移影響。采用融合率達到90％以上的細胞做水平劃痕，按預設分組的無血清培養(yǎng)體系處理細胞24h，處理結束后，鏡下觀察并測量原細胞劃痕的寬度變化及細胞水平遷移情況。
　　

6、6.為了驗證高濃度葡萄糖誘導對于大鼠主動脈平滑肌細胞(VSMCs)細胞水平遷移影響，以及驗證奧美沙坦對該影響是否有治療作用。對細胞進行24h去血清預處理后，按預設分組處理細胞72h，處理結束后，提取細胞總蛋白，Western Blot法檢測各處理組細胞中ACE2、Mas蛋白表達量的改變。
　　【結果】
　　1.與正常糖組相比，甘露醇對照組未見明顯改變，高糖組MTT結果顯示高增殖。奧美沙坦組增殖較高糖組減少，抑制劑組增殖高于奧

7、美沙坦組。
　　2.與正常糖組相比，甘露醇對照組未見明顯改變，高糖組細胞周期G0/G1比例降低。奧美沙坦組G0/G1期比例較高糖組增高，抑制劑組G0/G1期比例低于奧美沙坦組。
　　3.正常糖組24h未見明顯細胞遷移，甘露醇對照組表現大致同正常糖組，高糖組24h見明顯細胞外遷。奧美沙坦細胞遷移少于高糖組，抑制劑組細胞遷移明顯高于奧美沙坦組。
　　4. Western Blot結果顯示，與正常糖組相比，高糖組 ACE2、