CaN-NFAT信號通路在應力介導的成肌細胞凋亡中的作用及其作用機制.pdf

1、目的:頜面部肌肉組織的適應性改建在正畸功能矯形中都發(fā)揮了重要作用。成肌細胞是構成頜面部肌肉組織的重要組成部分，是適應性改建的主要體現(xiàn)者。目前多數(shù)學者的研究集中于成肌細胞的分化、增殖等方面，忽視了成肌細胞凋亡方面的研究。而成肌細胞的凋亡與成肌細胞的分化、增殖一樣，在頜面部肌肉組織的生長和改建中發(fā)揮著重要的作用。本研究通過構建成肌細胞力學刺激模型研究周期性張應力對大鼠L6成肌細胞凋亡的影響，明確CaN-NFAT信號通路在應力介導的大鼠L6成

2、肌細胞凋亡中的作用，從而闡明功能矯形時成肌細胞適應性改建的分子機制，為正畸醫(yī)生治療錯頜畸形提供理論支持。
　　方法:本實驗應用多通道細胞牽張應力加載系統(tǒng)對大鼠L6成肌細胞構建的力學刺激模型分別施加0h、1h、2h、6h、12h、24h的周期性張應力(0h組即為對照組)，加載的力值為15％的細胞形變率，加載的頻率為10個循環(huán)/min，每個循環(huán)均包括3s拉伸和3s松弛;于倒置相差顯微鏡下對成肌細胞的形態(tài)學改變和生長狀況進行觀察;經(jīng)過H

3、oechst33258熒光染料染色后，采用熒光顯微鏡觀察凋亡的成肌細胞;采用流式細胞術分別分析各組成肌細胞的凋亡率;運用實時熒光定量PCR技術及Westernblot技術分別檢測周期性張應力作用下各組成肌細胞鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CaN)及NFAT的mRNA和蛋白含量;采用CaN的特異性抑制劑環(huán)孢素(CsA)明確CaN在周期性張應力介導的L6成肌細胞凋亡中的作用，從而進一步明確內(nèi)質網(wǎng)應激與應力介導的大鼠L6成肌細胞凋亡之間的關系。采用統(tǒng)計學軟

4、件SPSS17.0對所得的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。
　　結果:
　　1.大鼠L6成肌細胞在受到大小為15％細胞形變率，頻率為10個循環(huán)/min的周期性張應力后，貼壁生長情況良好，細胞無變性并且脫落率極低，說明成肌細胞體外培養(yǎng)-力學刺激模型構建成功;
　　2.當大鼠L6成肌細胞受到長時間的周期性張應力作用后，細胞排列方向由原先的雜亂無章變?yōu)轫槕龇较蚺帕校⑶译S著應力作用時間變長，細胞排列方向變得更加明顯;
　　3.

5、Hoechst33258熒光染色及流式細胞術的檢測結果顯示15％的細胞形變率，10個循環(huán)/min的周期性張應力誘導大鼠L6成肌細胞發(fā)生凋亡，并且在一定的作用時間范圍內(nèi)，成肌細胞的凋亡率隨著應力作用時間的延長而升高，在24h達到高峰;
　　4.實時熒光定量PCR的檢測結果顯示，隨著應力作用時間的延長，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CaN)及NFAT的mRNA表達量均有所增加;Western blot的檢測結果顯示，隨著應力作用時間的延長，NFAT

6、的蛋白量也有所增加，這與PCR的檢測結果相符;可見，CaN-NFAT信號通路參與了周期性張應力作用下的大鼠L6成肌細胞的力學信號傳導。
　　5.CaN的特異性抑制劑環(huán)孢素(CsA)抑制CaN活性后，成肌細胞的凋亡率下降，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CaN)和NFAT的mRNA表達量、NFAT的蛋白量下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　結論:
　　1.15％的細胞形變率，10個循環(huán)/min的周期性張應力可以誘導大鼠L6成