Ca2+-CaN-NFAT信號途徑在Mfn2調節(jié)T細胞功能中作用.pdf

1、目的:線粒體融合蛋白2(Mfn2)作為線粒體外膜上了一種跨膜GTP酶，除了介導線粒體融合外，還參與了細胞能量代謝、增殖及凋亡等眾多細胞生物學過程;Ca2+-CaN-NFAT信號通路在T細胞的增殖、分化等生命過程中發(fā)揮關鍵作用，同時Mfn2對維持T細胞活化過程中的鈣離子信號有重要作用。前期實驗證明，HMGB1能夠時間/劑量依賴性的抑制T淋巴細胞的免疫功能，同時抑制Mfn2的表達;過表達MFN2能夠減輕HMGB1的抑制效應，并且其機制可能是

2、通過Ca2+-NFAT信號通路而實現(xiàn)。然而，Mfn2調節(jié)T淋巴細胞功能的具體機制尚不清楚。因此，本研究通過構建攜帶Mfn2基因及其干擾序列的慢病毒載體（LV-Mfn2及LV-Mfn2RNAi）轉染T淋巴細胞系，探索Mfn2對T淋巴細胞免疫功能的影響及Ca2+-CaN-NFAT信號通路在該過程中的作用。
　　 方法:體外培養(yǎng)人T細胞淋巴瘤細胞系Jurkat細胞，用含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基調整細胞濃度為1×106/m

3、l，然后接種于6孔板，對其進行慢病毒轉染后進行效果驗證，符合要求后進行分組，在0h，6h，12h，24h，48h時間點處用濃度為50ng/ml PMA/1uM Ionomycin進行刺激。實驗一:在上述不同時間點使用P/I進行刺激，MTT法檢測Jurkat T淋巴細胞增殖，ELISA檢測細胞上清液中細胞因子IL-2，IL-4，IFN-γ的表達，分析時間效應關系;同時采用流式細胞術Fluo-3AM檢測胞漿鈣離子水平，Western blo

4、t法檢測CaN的改變，ELISA法檢測NFAT活化情況，觀察調節(jié)Mfn2的表達對Ca2+-CaN-NFAT信號通路各個環(huán)節(jié)的影響。實驗二:根據(jù)以上結果找出最佳刺激時間點，然后分別使用LV-CAN和終濃度為20ng/ml的FK506來調節(jié)CAN的表達，在該時間點下分別采用MTT法檢測JurkatT淋巴細胞增殖，ELISA檢測細胞上清液中細胞因子IL-2，IL-4，IFN-γ的表達，觀察改變CAN的表達對Mfn2引起T細胞免疫功能變化的影響

5、。Western blot法驗證各組CAN的改變，并且采用ELISA法檢測NFAT活化情況，明確CAN在該信號通路中的關鍵地位。
　　 結果:
　　 1.調節(jié)Mfn2的表達對T淋巴細胞免疫功能的影響及信號機制的探究：(1)慢病毒載體驗證結果顯示，LV-Mfn2RNAi-RFP組mRNA和Mfn2蛋白表達明顯下調;反之，LV-Mfn2-GFP組mRNA和Mfn2蛋白表達明顯升高。(2)Mfn2干擾組在P/I刺激劑作用24h

6、增殖能力，細胞上清液中IL-2的水平，細胞因子IFN-γ/IL-4比值明顯抑制; Mfn2過表達組細胞在P/I刺激劑作用24h上述指標顯著增加。(3) Mfn2干擾組24hT細胞胞漿鈣離子水平，CAN的表達，核轉錄因子NFAT活性明顯低于對照組及空載體組;Mfn2過表達組細胞在刺激24h上述指標顯著增加。
　　 2.調節(jié)CaN的活性對Mfn2改變T細胞功能的影響及NFAT的變化：(1)上調CAN的表達對抑制Mfn2表達后T淋巴細

7、胞增殖功能、IL-2分泌、IFN-γ/IL-4比值降低的影響:MFN2干擾組細胞增殖程度、IL-2分泌水平、IFN-γ/IL-4比值較空載體組明顯降低;轉染LV-CAN使鈣調磷酸酶表達升高之后，被抑制的細胞增殖、IL-2分泌、IFN-γ/IL-4比值可被逆轉。(2)抑制CAN的活性(FK-506)對上調Mfn2表達后T淋巴細胞增殖功能、IL-2分泌、IFN-γ/IL-4比值升高的影響:Mfn2過表達組細胞增殖程度，IL-2水平，IFN-

8、γ/IL-4比值較空載體組顯著增高;當使用FK506降低CAN的表達后，升高的細胞增殖、IL-2分泌、IFN-γ/IL-4比值可被逆轉。(3)轉染LV-CAN對下調Mfn2表達后CAN、NFAT表達下降的影響:Mfn2干擾組CAN表達，NFAT活性較空載體組明顯降低;轉染LV-CAN使鈣調磷酸酶表達升高，被抑制的CAN表達,NFAT在一定程度上可被逆轉。(4)抑制CAN的活性(FK-506)對上調Mfn2表達后T細胞CAN、NFAT活性

9、升高的影響: Mfn2過表達組CAN表達,NFAT活性較空載體組組明顯升高，當使用FK506降低CAN的表達，升高的CAN的表達，NFAT活性明顯受到抑制。
　　 結論:
　　 1.上調Mfn2表達能夠增強T淋巴細胞增殖能力，IL-2的分泌，增強T細胞的免疫功能;并且Mfn2表達增加能夠顯著提高胞漿Ca2+，CAN及NFAT的表達，反之干擾MFN2表達效應完全相反。提示Mfn2可能在膿毒癥功能免疫紊亂中占有一席之地，并且