不同Synaptotagmin在調節(jié)LβT2細胞分泌中的功能研究.pdf

1、Synaptotagmin (Syt) 是一個廣泛存在于神經和內分泌細胞內的分泌囊泡上的蛋白質家族。作為鈣離子依賴性神經遞質和激素釋放過程中的鈣離子感受器，Syt觸發(fā)和調節(jié)囊泡與靶膜的融合過程，參與對神經遞質和激素釋放過程的嚴格調控，也可能參與對細胞的蛋白質與膜轉運的調節(jié)。該家族在哺乳動物中有16種以上的亞型，它們在細胞內有各自不同的定位，并發(fā)揮不同的調節(jié)功能。通過亞型間以及亞型和效應物分子間的相互作用，特別是對鈣離子的結合，Syt對胞

2、吐過程進行著有效地調控。在膜融合的事件中，大部分是需要鈣離子的存在的。Syt可能是一種在較為寬廣范圍的膜融合事件中廣泛分布的鈣離子敏感的融合機制中的調控蛋白。 本課題以一種鼠源性傳代促性腺激素釋放細胞系LβT2細胞為研究對象深入研究Syt在細胞分泌中的分子調控機制。垂體促性腺激素釋放細胞分泌促性腺激素，在生殖系統(tǒng)中起到中心調節(jié)的作用，其分泌活動的異常會直接影響到生長發(fā)育和性功能成熟等。對分泌的機制以及它的調控機制的研究，對于進一

3、步正確認識分泌現(xiàn)象的本質，對于那些與分泌有關的疾病的治療及相關藥物的開發(fā)都有著重要的現(xiàn)實意義。 Syt家族是多亞型的蛋白家族，因此需要應用一種高效篩選方法，研究每種Syt在細胞分泌中的分子調控機制。本實驗應用RNA干擾 (RNA interference，RNAi) 技術，在RNA的轉錄后階段將Syt基因的表達進行沉默，形成knockdown的效果，并在此基礎上對沉默的Syt基因進行功能變化的檢測。實驗使用短暫 (～1.5 ms

4、) 強紫外光裂解光敏感的Ca2+螯合物NP-EGTA，使胞漿內的鈣離子濃度 [Ca2+]I 快速 (<2ms) 升高到～20微摩爾，刺激細胞分泌，并同時測量膜電容和鈣離子濃度。在本研究課題中，我們將Syt IV和Syt VII分別與EGFP (Enhanced green fluorescent protein，增強綠色熒光蛋白) 融合，構建了pEGFP-N1-Syt IV和pEGFP-N1-Syt VII表達載體。采用全內反射成像技術

5、，詳細地研究各種Syt亞型的細胞內定位。 實驗結果表明 (1)通過選擇合適的目標序列，經shRNA沉默的細胞中Syt I、IV、VII、IX的表達量為野生型細胞表達量的27％、36％、32％和25％。 (2)Syt I蛋白表達沉默對分泌的快速簇發(fā)相 (Fast burst)，慢速簇發(fā)相 (Slow burst) 和持續(xù)相 (Sustained) 的大小都沒有顯著影響；Syt VII蛋白表達沉默對分泌的快速簇發(fā)相和

6、持續(xù)相的幅度都沒有顯著影響，但選擇性地減少了慢速簇發(fā)相的幅度；Syt IX蛋白表達沉默顯著性地減少快速簇發(fā)相和持續(xù)相，但對慢速簇發(fā)相沒有顯著的影響。 (3)Syt IX (本實驗室已有質粒) 標記的囊泡與用NPY-DsRed標記的致密核心大囊泡共存，Syt VII標記的囊泡與用CD63-TDimer2標記的溶酶體共存。 從以上實驗結果，我們推測分泌的快速簇發(fā)相和慢速簇發(fā)相可能由不同的Syt介導；由于Syt VII定位于溶