調節(jié)性T細胞功能穩(wěn)定性及其在免疫治療中的作用機制研究.pdf

1、CD4+CD25+Foxp3+調節(jié)性T細胞(Tregs)在維持機體免疫平衡中起著重要作用，而Foxp3在Treg的表達水平與Treg的功能直接相關?；A與臨床的多項研究已證實Tregs能夠治療多種疾病，包括自身免疫性糖尿病，實驗性關節(jié)炎等。目前，如何培養(yǎng)穩(wěn)定，有效的Tregs功能是其研究的熱點。有研究小組發(fā)現Tregs在炎癥環(huán)境下不穩(wěn)定，容易失去Foxp3表達，同時失去Foxp3的前Tregs表達大量的IL-17，從而加重疾病反應。因此

2、，本課題旨在分析和探究能夠獲得穩(wěn)定Tregs的最佳方案。并檢測與Tregs穩(wěn)定性關系重大的相關標志物及其相關的信號通路。本課題的成功對Tregs臨床治療具有一定的普遍意義并為移植術后免疫耐受的誘導提供新的思路。
　　本文主要從以下幾方面進行論述：
　　第一部分 TGF-β誘導的CD4+Foxp3+iTregs在急性移植物抗宿主病中的作用和機制研究。
　　誘導型調節(jié)性T細胞(induced regulatoryT cel

3、ls，iTregs)被認為可以用來治療自身免疫性疾病。然而最新研究發(fā)現其在急性移植物抗宿主病模型中療效不明顯，其原因在于iTregs功能不穩(wěn)定，在體內容易轉化為其他細胞，從而失去免疫抑制功能。本文旨在探討iTregs在急性移植物抗宿主病中功能及穩(wěn)定性的影響。
　　目的:通過研究iTregs在急性移植物抗宿主病模型中的作用，鑒別不同iTregs培養(yǎng)方案對其細胞功能的影響。
　　方法:運用TGF-β，IL-2誘導iTregs治療

4、兩種不同的小鼠急性移植物抗宿主病模型。在一些實驗中CFSE標記的Tregs被注入小鼠體內來監(jiān)測Tregs體內的穩(wěn)定性?？笴D25抗體被用來拮抗Tregs，觀測拮抗Tregs后，移植物抗宿主病模型的生存率。最后，還監(jiān)測了不同方案的iTregs的體外與體內穩(wěn)定性和功能。
　　結果:iTregs具有較強的保護急性移植物抗宿主病的功能，這種保護作用是通過iTregs抑制供者CD4細胞，CD8細胞的擴增以及供者CD8細胞的殺傷作用，保護受者

5、B細胞來實現的。在體內實驗中，觀測到iTregs能夠保持穩(wěn)定并持續(xù)發(fā)揮功能，最后的研究還發(fā)現anti-CD3/CD28磁珠誘導的iTregs比anti-CD3包板誘導的iTregs具有更強的免疫調節(jié)功能。
　　結論:只有運用正確的誘導擴增方案，才能夠培養(yǎng)出狀態(tài)穩(wěn)定，具有強大抑制功能的iTregs，從而保護急性移植物抗宿主病。
　　第二部分 全反式維甲酸對肝臟移植術后患者iTregs的作用研究
　　目的:通過全反式維甲酸

6、作用肝臟移植術后患者iTregs，分析全反式維甲酸對iTregs功能的影響。
　　方法:運用TGF-β，IL-2與全反式維甲酸從肝臟移植術后患者提取的幼稚T細胞中的誘導iTregs，檢測Foxp3表達，體外擴增功能。通過CFSE標記的T細胞與iTregs共培養(yǎng)，觀察全反式維甲酸作用的iTregs的體外抑制功能。同時，建立小鼠異種移植物抗宿主病模型，并由尾靜脈回輸iTregs觀察iTregs對異種移植物抗宿主病的保護作用以及相關細胞

7、因子表達情況。
　　結果與結論:全反式維甲酸能夠增強患者iTregsFoxp3的表達以及擴增倍數，同時提高iTregs的體內與體外功能。本研究為iTregs在臨床治療的實際問題提供了新的解決方案。
　　第三部分 人CD39hi nTreg亞群的穩(wěn)定性和功能研究及其相關機制分析
　　自然調節(jié)性T細胞(natural regulatory T cells，nTregs)被認為可以用來治療自身免疫性疾病。然而研究表明其在炎癥

8、環(huán)境下易轉化為Th1，Th17細胞，從而失去免疫抑制功能，CD39是與Tregs功能相關的表面標志，可能與Tregs的穩(wěn)定性有關。
　　目的:通過研究CD39hi nTregs與CD39low nTregs在炎癥環(huán)境下的表型和穩(wěn)定性差異，為臨床運用具有功能的調節(jié)性T細胞誘導免疫耐受提供實驗依據。
　　方法:分選出人CD4+CD25brightnTreg并在體外培養(yǎng)擴增7天，流式分選出CD39hi nTreg和CD39low

9、nTreg加入IL-1β或者IL-6繼續(xù)培養(yǎng)1至3天，將獲得的nTregs進行體內外抑制功能檢測，利用免疫印跡法檢測STAT1，p-STAT1，STAT3，p-STAT3的表達水平，并分析Foxp3啟動子區(qū)域的變化。體內實驗采用不同類型nTregs回輸異種移植物抗宿主疾病。
　　結果:CD39hi nTregs比CD39low nTregs具有更加強大的免疫抑制功能，在體外實驗中，CD39hi nTregs能夠保持Foxp3表達，

10、具有較強的抑制T細胞擴增的能力;而CD39low nTregs快速丟失Foxp3表達，并轉化為Th1，Th17細胞。在體內實驗中，CD39hi nTregs能夠保護異種移植物抗宿主病的體重變化，提高生存率。最后，IL-2能夠顯著提高CD39low nTregs的體內功能和穩(wěn)定性，這種作用與STAT1，STAT3磷酸化和DNA甲基化水平有關。
　　結論:nTregs的穩(wěn)定性與CD39表達有關，Tregs體外擴增后分選CD39hinT