調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在MCMV致病機制中的作用.pdf

1、目的：
　?、僭谡w水平研究小鼠巨細(xì)胞病毒(murine cytomegalovirus,MCMV)急慢性感染對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells,Treg)增殖活化的影響;
　　②建立添加和去除Treg的T淋巴細(xì)胞和 MCMV感染小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryo fibroblasts,MEF)體外共培養(yǎng)體系,探明Treg在MCMV中發(fā)揮的免疫效應(yīng)及其可能機制;
　?、垩芯看笏庑滤貙藜?xì)胞

2、病毒感染誘導(dǎo)的Treg異常擴增的作用及其可能機制。
　　方法：
　　①建立MCMV全身播散型感染小鼠模型:4周齡BABL/c小鼠,腹腔接種(5×103)PFU Smith株病毒,建立全身播散型感染模型。根據(jù)蝕斑法檢測的主要臟器內(nèi)病毒滴度,確定本模型急慢性感染期的界定點;
　　②整體研究:根據(jù)大蒜新素成人中效劑量(120mg/d)換算出小鼠用藥的一般劑量(25mg/kg·d);120只模型鼠隨機分為安慰劑組和大蒜新素治療

3、組;并設(shè)120只同期模擬感染小鼠為對照,隨機分為模擬感染對照組和大蒜新素對照組。病毒接種后24h開始藥物治療,腹腔注射大蒜新素后24h記為1d。分別于大蒜新素處理后1d、3d、7d、14d、28d、45d、60d、75d、90d和120d處死小鼠,獲得脾細(xì)胞待測。采用Western blot法檢測脾細(xì)胞中特異性轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的蛋白表達強度;流式細(xì)胞術(shù)分析CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞在脾細(xì)胞中所占比率的變化。
　　

4、③T淋巴細(xì)胞和CD4+CD25+Treg的純化:從MCMV預(yù)感染2個月的BALB/c小鼠體內(nèi)分離得到脾細(xì)胞,尼龍毛柱法純化T淋巴細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)驗證T淋巴細(xì)胞純度;純化的T淋巴細(xì)胞再經(jīng)MACS Treg kit磁珠分選獲得CD4+CD25+雙陽性Treg細(xì)胞和已去除了Treg的T淋巴細(xì)胞(T cells depletion of Tregs,TdepTreg),流式細(xì)胞術(shù)驗證CD4+CD25+Treg細(xì)胞純度。
　?、荏w外研究MC

5、MV感染對Treg細(xì)胞增殖活化的影響:MCMV感染MEFs(記為MEFMCMV,感染復(fù)數(shù)為1.0)后與含或不含Treg細(xì)胞的T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)建立添加和去除Treg的細(xì)胞培養(yǎng)模型。分別采用Real-time PCR和流式細(xì)胞術(shù)檢測Treg特異性轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的基因表達強度和CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞比率,明確有無Treg細(xì)胞擴增。
　?、菡{(diào)節(jié)性T細(xì)胞對抗病毒細(xì)胞免疫的影響:在添加和去除Treg的細(xì)胞培養(yǎng)模型中,分

6、別通過流式細(xì)胞術(shù)分析效應(yīng)性T細(xì)胞亞群Tc1( CD3+CD8+IFN-γ+)、Tc2(CD3+CD8+IL-4+)、Th1(CD3+CD8-IFN-γ+)、Th2(CD3+CD8-IL-4+)比率變化、Western blot和Real-time PCR方法檢測Th1/Th2特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet/GATA-3基因和蛋白表達強度、雙抗體夾心ELISA方法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4蛋白表達水平、標(biāo)準(zhǔn)蝕斑法檢測共培養(yǎng)體

7、系的感染性病毒量來明確Treg細(xì)胞對MCMV感染所誘導(dǎo)的抗病毒細(xì)胞免疫效應(yīng)的影響。
　　⑥調(diào)節(jié)性T細(xì)胞發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)的機制研究:在添加和去除Treg培養(yǎng)體系中,采用雙抗體夾心ELISA法檢測共培養(yǎng)細(xì)胞上清中TGF-β1和IL-10蛋白表達水平。
　?、?MCMV誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞擴增的機制研究:MCMV感染MEFs后(感染復(fù)數(shù)為1.0)與尼龍毛柱純化的T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)建立T淋巴細(xì)胞-MEFMCMV共培養(yǎng)體系;分別在共培養(yǎng)前、

8、共培養(yǎng)1d和3d后,采用RT-PCR法和雙抗體夾心ELISA法研究MCMV感染對小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor, TGF)-β1基因和培養(yǎng)上清中TGF-β1蛋白表達的影響;用單克隆抗體阻斷TGF-β1和/或IL-10達3天后,分別采用Western blot法和流式細(xì)胞術(shù)分析Foxp3蛋白表達和Treg比率的變化以明確TGF-β1和IL-10在MCMV誘導(dǎo)Treg擴增機制中的作用。

9、
　　⑧根據(jù)添加和去除Treg研究所得結(jié)果,選取Treg細(xì)胞發(fā)揮抑制效應(yīng)最顯著一組觀測大蒜新素對Treg的影響:使用MTT法測定小鼠胚胎成纖維細(xì)胞對大蒜新素的最大耐受濃度(maximum tolerance concentration, MTC);MTC大蒜新素處理3d后, Real-time PCR法檢測T細(xì)胞中Foxp3 mRNA表達水平;流式細(xì)胞術(shù)分析效應(yīng)性T細(xì)胞亞群比率;雙抗體夾心ELISA法檢測上清中TGF-β1和IL-

10、10蛋白表達水平變化;標(biāo)準(zhǔn)蝕斑法測定MTC大蒜新素對體系中感染性病毒量的影響。
　　結(jié)果：
　?、僭诟腥?8d后,肝、腎、心、肺組織內(nèi)均不能分離到感染性病毒,因此確定感染后第28天為動物模型急慢性期界定點;
　　②在體實驗發(fā)現(xiàn),MCMV感染小鼠脾細(xì)胞中Foxp3蛋白表達與CD4+CD25+Foxp3+Treg比率的動態(tài)變化規(guī)律相似,均在MCMV急性感染后期逐漸下降,于感染后28d降至最低;進入感染慢性期后,Foxp3蛋

11、白表達和Treg細(xì)胞比率呈直線上升趨勢,分別在感染后45d和60d顯著高于模擬感染對照組水平,并均于120d時增至峰值;大蒜新素對正常小鼠脾細(xì)胞中Foxp3蛋白表達和Treg細(xì)胞比率均無顯著影響;但是在MCMV感染小鼠,大蒜新素卻可在感染慢性期顯著減少Foxp3蛋白表達強度、降低調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比率,表明MCMV在感染慢性期可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞異常增殖活化,而大蒜新素可糾正這一免疫紊亂。
　?、凼褂媚猃埫兓疶淋巴細(xì)胞,CD3陽性率

12、為(88.16±3.24)％;經(jīng)磁珠分選得到的CD4+CD25+雙陽性細(xì)胞比率大于95%,其中95%的雙陽性細(xì)胞表達Foxp3。
　?、茉谔砑雍腿コ齌reg細(xì)胞模型中,MCMV感染3d后可顯著增加T淋巴細(xì)胞中Foxp3的基因表達水平和Treg細(xì)胞比率,提示MCMV感染在體外同樣可以誘導(dǎo)Treg細(xì)胞增殖活化。
　?、萏砑雍腿コ齌reg細(xì)胞模型中,不含Treg的T淋巴細(xì)胞與MEFMCMV共培養(yǎng)3d后,病毒負(fù)荷量顯著低于感染對照組

13、(P<0.01);向該體系中添加Treg可增加感染性病毒量,且該效應(yīng)與Treg比率呈正性相關(guān)。TdepTreg與MEFMCMV共培養(yǎng)3d后,體系中各效應(yīng)性T細(xì)胞亞群細(xì)胞數(shù)目均較非感染對照組顯著增加。增加體系中的Treg比率后,共培養(yǎng)體系中Tc1、Tc2和Th1細(xì)胞數(shù)目均不同程度減少,且該效應(yīng)與Treg比率呈負(fù)相關(guān);而Th2細(xì)胞數(shù)量僅在Treg比率增至20%時才顯著低于TdepTreg-MEFMCMV共培養(yǎng)體系(P<0.05)。Pears

14、on相關(guān)分析顯示,Treg與Tc1、Tc2和Th1均呈顯著負(fù)性線性相關(guān),而Th2僅與Treg呈部分負(fù)性線性相關(guān)。與TdepTreg-MEFMCMV共培養(yǎng)體系比較,添加Treg可顯著增加IL-10和TGF-β1的表達,且相關(guān)分析表明增加的IL-10和TGF-β1主要是由Treg分泌的。
　?、拊赥細(xì)胞-MEF細(xì)胞模型中,MCMV感染MEF后,培養(yǎng)上清中TGF-β1蛋白表達和MEF中TGF-β1基因表達的變化趨勢一致,均隨感染時間延長

15、而顯著增加,并在感染后第3d分別增至感染前的2倍(P<0.01)和3倍(P<0.01)水平。
　?、咴赥細(xì)胞-MEF細(xì)胞模型中,單獨阻斷IL-10對Foxp3蛋白表達和Treg比率無影響;而單獨阻斷TGF-β1卻可部分抵消MCMV感染誘導(dǎo)的Foxp3蛋白表達增強和Treg比率增加,聯(lián)合阻斷效應(yīng)與單獨阻斷TGF-β1效應(yīng)相一致,提示在體外MCMV誘導(dǎo)Treg擴增是部分依賴于TGF-β1的。
　　結(jié)論：
　?、俳⑷聿ド?/p>

16、型MCMV感染小鼠模型,動態(tài)監(jiān)測發(fā)現(xiàn),MCMV在進入感染慢性期后出現(xiàn)抑制性T細(xì)胞亞群Treg的進行性數(shù)量增加和功能活化,推測Treg可能在CMV致慢性化感染機制中發(fā)揮重要作用。
　　①建立添加和去除Treg的細(xì)胞共培養(yǎng)模型,體外模擬MCMV感染細(xì)胞的免疫環(huán)境,發(fā)現(xiàn)MCMV在體外同樣可顯著誘導(dǎo)Treg擴增;擴增的Treg可能主要通過分泌抑制性細(xì)胞因子IL-10、TGF-β1等途徑抑制各效應(yīng)性T細(xì)胞亞群的分化和功能發(fā)揮;由于Treg抑

17、制作用的不均衡性,導(dǎo)致Th1/Th2、Tc1/Tc2平衡失調(diào),從而創(chuàng)造了一個使病毒能夠持續(xù)存在的有利免疫環(huán)境,這可能是CMV逃避宿主免疫、實現(xiàn)持續(xù)或慢性感染的又一重要機制。
　　② MCMV感染導(dǎo)致宿主細(xì)胞(MEF)TGF-β1表達水平升高,可能是其在外周誘導(dǎo)初級Treg形成、實現(xiàn)Treg種群擴增的重要機制之一。
　?、鄢苯託⒉《咀饔猛?大蒜新素在體內(nèi)外均可顯著糾正MCMV感染導(dǎo)致的Treg異常擴增。大蒜新素抑制TGF-β