調(diào)節(jié)性B細(xì)胞在胃癌免疫調(diào)控中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：免疫調(diào)節(jié)在胃癌發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。近來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)一群具有調(diào)節(jié)作用的B淋巴亞群——稱為調(diào)節(jié)性B淋巴細(xì)胞(regulatory B cells，Breg)。Breg在自身免疫性疾病中的研究已經(jīng)取得了初步研究結(jié)果，但是Breg在胃癌中的作用并不清楚。本研究以原發(fā)性胃癌(gastric cancer，GC)為研究對(duì)象，檢測(cè)調(diào)節(jié)性B淋巴細(xì)胞(Breg)在胃癌中的百分比變化，探討其在胃癌中的表面標(biāo)志特性，研究Breg細(xì)胞在胃癌中可能

2、的作用及相關(guān)機(jī)制，為調(diào)節(jié)性B淋巴細(xì)胞在胃癌及人類腫瘤甚至其在其他疾病中的研究提供研究基礎(chǔ)。
　　方法：(1)用流式細(xì)胞儀分析的方法測(cè)定40例健康對(duì)照組(Healthy control，HC)和107例原發(fā)性胃癌患者(gastric cancer，GC)外周血中CD19+B淋巴的百分比的狀況，研究胃癌患者外周血B淋巴百分比與其腫瘤TNM分期的關(guān)系。免疫組織化學(xué)染色的方法檢測(cè)不同TNM分期胃癌患者腫瘤組織局部CD19+B淋巴細(xì)胞的分布

3、情況。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)的方法檢測(cè)和分析胃癌患者正常組織、癌旁組織及腫瘤組織中CD19+B淋巴細(xì)胞(CD45+CD19+)在淋巴細(xì)胞中的百分比。(2) ELISA方法檢測(cè)胃癌患者血清中分泌的細(xì)胞因子IL-10的水平。流式細(xì)胞術(shù)分析胃癌患者外周血PBMC及癌旁組織及腫瘤組織B淋巴細(xì)胞中CD19+ IL-10+B淋巴細(xì)胞的百分比。(3)采用多色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表面標(biāo)志CD5、CD1d、CD24、CD38、IgM、CD25、CD10、CD21、CD

4、20各指標(biāo)在IL-10+B淋巴細(xì)胞和IL-10-B淋巴細(xì)胞表面平均熒光強(qiáng)度(MFI)表達(dá)的不同，確定Breg細(xì)胞合適的表面標(biāo)志為CD19+ CD24hiCD38hi。(4)流式細(xì)胞術(shù)分析胃癌患者外周血PBMC及腫瘤組織淋巴細(xì)胞中CD19+CD24hi CD38hi在CD19+B淋巴細(xì)胞的百分比變化，分析Breg細(xì)胞百分比與腫瘤TNM分期的可能關(guān)系。(5)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析胃癌患者體內(nèi)中CD3+T淋巴細(xì)胞、CD3+ CD4+ Th淋巴細(xì)胞

5、、CD3+ CD8+ Tc淋巴細(xì)胞、CD3-CD19+B淋巴細(xì)胞、CD3-(CD16+56)+NK淋巴細(xì)胞、CD3+(CD16+56)+ NKT淋巴細(xì)胞的百分比，詳細(xì)分析胃癌患者中各功能細(xì)胞亞群如CD4+ IFN-γ+ Th1細(xì)胞、CD4+ IL-4+ Th2細(xì)胞和CD4+ FoxP3+ Treg細(xì)胞的百分比變化。(6)進(jìn)一步分析胃癌患者中CD19+CD24hi CD38hi Breg細(xì)胞與各細(xì)胞亞群的相關(guān)關(guān)系。(7)采用流式細(xì)胞分選技

6、術(shù)、CFSE染色、細(xì)胞共培養(yǎng)、流式細(xì)胞檢測(cè)等方法研究CD19+ CD24hi CD38hi Breg細(xì)胞對(duì)CD3+T淋巴細(xì)胞、CD3+ CD4+ Th淋巴細(xì)胞、CD3+ CD8+ Tc淋巴細(xì)胞亞群增殖的影響，檢測(cè)Breg細(xì)胞對(duì)Th淋巴細(xì)胞、Tc淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響，檢測(cè)Breg細(xì)胞對(duì)Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)化生成的影響。(8)通過(guò)功能抗體中和阻斷實(shí)驗(yàn)評(píng)估IL-10及TGF-β在Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程中是否起到作用。研究中統(tǒng)計(jì)分析采用Graph

7、Pad Prism5.0軟件分析。
　　結(jié)果：(1)40例健康對(duì)照和107例胃癌患者外周血標(biāo)本中B淋巴細(xì)胞的百分比無(wú)明顯差異（14.03％±4.39％ vs15.06％±7.47％，P＞0.05）。(2)胃癌患者不同TNM分期（Ⅰ期18例、Ⅱ期40例、Ⅲ期46例和Ⅳ期3例），分析其外周血中B淋巴細(xì)胞百分比與TNM分期的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)不同TNM分期其外周血中B淋巴細(xì)胞百分比不同，Ⅰ期＞Ⅱ期＞Ⅲ期，但Ⅳ期例外:TNMⅢ期胃癌患者外周血CD

8、19+B淋巴細(xì)胞的百分比顯著低于TNMⅠ期患者(P＜0.001)，而且低于TNMⅡ期患者(P＜0.05)，而TNMⅣ患者外周血B淋巴細(xì)胞百分比增高，高于TNMⅢ期患者，兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。(3)流式細(xì)胞術(shù)及免疫組織化學(xué)染色都檢測(cè)到大量B淋巴細(xì)胞在腫瘤組織局部的聚集。(4)ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)胃癌患者外周血中細(xì)胞因子IL-10明顯高于健康對(duì)照組(P＜0.001)。流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)胃癌患者外周血中CD19+ IL-1

9、0+B細(xì)胞百分比顯著高于健康對(duì)照組(P＜0.001)。采用流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)方法，檢測(cè)胃癌患者外周血PBMC及癌旁組織、腫瘤組織B淋巴細(xì)胞中CD19+IL-10+B淋巴細(xì)胞的百分比，發(fā)現(xiàn)胃癌患者腫瘤組織中CD19+ IL-10+B細(xì)胞百分比高于癌旁組織(P＜0.05)，顯著高于外周血PBMC(P＜0.01)。(5)多色流式細(xì)胞術(shù)分析IL-10+B淋巴細(xì)胞表面的特征發(fā)現(xiàn)，IL-10+B淋巴細(xì)胞上CD5、CD38、CD24和CD25的熒光強(qiáng)度

10、明顯高于IL-10-B淋巴細(xì)胞(P＜0.001)，IL-10+B淋巴細(xì)胞上CD1d、IgM和CD10的熒光強(qiáng)度高于IL-10-B淋巴細(xì)胞(P＜0.01)，IL-10+B淋巴細(xì)胞上CD21的熒光強(qiáng)度高于IL-10-B淋巴細(xì)胞(P＜0.05)，而CD20的表達(dá)在IL-10+B淋巴細(xì)胞和IL-10-B淋巴細(xì)胞兩群細(xì)胞之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。分析發(fā)現(xiàn)CD19+ CD24hi CD38hi B細(xì)胞分泌大量IL-10，以此表面標(biāo)記作為胃癌

11、中Breg細(xì)胞的表面特征，用于后續(xù)的功能研究。(6)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，胃癌患者組外周血中CD19+ CD24hi CD38hi Breg細(xì)胞百分比顯著高于健康對(duì)照組(P＜0.001)，將胃癌早期（即TNMⅠ期和TNMⅡ期）與胃癌晚期（即TNMⅢ期和TNMⅣ期）比較分析，統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)CD19+ CD24hi CD38hi Breg細(xì)胞百分比隨著TNM分期的增加而有增高的趨勢(shì)，但兩組間并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。(7)流式細(xì)胞術(shù)分析胃癌患者

12、中各功能細(xì)胞亞群如CD4+ IFN-γ+ Th1細(xì)胞、CD4+ IL-4+ Th2細(xì)胞和CD4+ FoxP3+ Treg細(xì)胞的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)胃癌患者外周血CD4+ IFN-γ+ Th1細(xì)胞的百分比明顯低于健康對(duì)照組(P＜0.01)，Th2細(xì)胞的百分比在健康對(duì)照組和胃癌患者組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，發(fā)現(xiàn)胃癌患者外周血中Treg細(xì)胞的百分比明顯高于健康對(duì)照組(P＜0.01)。(8)進(jìn)一步分析胃癌患者中CD19+ CD24hi CD38hi Breg細(xì)

13、胞與各細(xì)胞亞群的相關(guān)關(guān)系。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，Breg細(xì)胞與CD3+T淋巴細(xì)胞(R=0.3917，P＜0.05）、CD3+ CD8+ Tc淋巴細(xì)胞(R=0.5100，P＜0.01)具有直線相關(guān)性，而且Breg細(xì)胞與CD4+ FoxP3+ Treg細(xì)胞具有較好的直線相關(guān)性(R=0.4252，P＜0.01)。(9)研究CD19+ CD24hi CD38hiBreg細(xì)胞功能發(fā)現(xiàn)，Breg細(xì)胞對(duì)CD3+T細(xì)胞、Th細(xì)胞、Tc細(xì)胞增殖無(wú)明顯影響(P＞0

14、.05)，但對(duì)CD4+ Th細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IFN-γ和TNF-a均具有明顯抑制作用(P＜0.01)。(10)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)CD19+ CD24hi CD38hi Breg細(xì)胞可以誘導(dǎo)CD4+ CD25-效應(yīng)性T細(xì)胞表達(dá)FoxP3水平顯著增高（P＜0.01）。而且研究發(fā)現(xiàn)，胃癌患者體內(nèi)的CD19+ CD24hiCD38hi Breg細(xì)胞可以誘導(dǎo)CD4+ CD25-效應(yīng)性T細(xì)胞表達(dá)FoxP3水平高于健康對(duì)照組(P＜0.05)。不僅Real

15、-Time PCR在mRNA水平上證實(shí)，流式細(xì)胞術(shù)也檢測(cè)到CD19+ CD24hi CD38hi Breg細(xì)胞除了可以分泌大量IL-10以外，也可以分泌大量TGF-β。通過(guò)中和實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在CD19+ CD24hi CD38hi Breg細(xì)胞誘導(dǎo)CD4+CD25-效應(yīng)性T細(xì)胞表達(dá)FoxP3的過(guò)程中，此功能的發(fā)揮不是依賴IL-10，而是依賴TGF-β。
　　結(jié)論：胃癌外周血中CD19+ CD24hi CD38hi Breg細(xì)胞百分比的

16、增高，而且隨著TNM分期增加存在著增高的趨勢(shì)，提示Breg細(xì)胞可能與腫瘤的發(fā)展相關(guān)。CD19+CD24hi CD38hi Breg可以抑制Th細(xì)胞因子的分泌，而且同時(shí)以TGF-3依賴的途徑誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的增多，Breg細(xì)胞可能打破了機(jī)體的抗腫瘤免疫，參與了胃癌的免疫逃逸，參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移?？紤]到Breg細(xì)胞在腫瘤中可能發(fā)揮的抑制腫瘤的效應(yīng)，特異性去除減少或降低胃癌患者體內(nèi)的Breg細(xì)胞的水平，或許可以提高機(jī)體的抗腫瘤免疫應(yīng)答