microRNA-34a在胃癌細(xì)胞中的作用及其調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、背景：
　　胃癌（gastric cancer）是一種具有較高發(fā)病率的惡性腫瘤，預(yù)后比較差。近年研究發(fā)現(xiàn)非編碼小RNA（microRNA）在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起著極其重要的作用。microRNA-34a（miR-34a）定位在人類染色體1p36，在人類腫瘤中常發(fā)生缺失，如乳腺癌、肺癌、胰腺癌和結(jié)腸癌等，但miR-34a與胃癌的關(guān)系至今未見報道，因此本研究擬探討miR-34a在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)及其調(diào)控機(jī)制，同時探討miR-34a

2、與胃癌細(xì)胞對化療敏感性之間的關(guān)系以及作用機(jī)制，為胃癌治療提供新方法和新的干預(yù)靶點(diǎn)。
　　方法：
　　在體外分別培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞系：MGC80-3、HGC-27、NCI-N87、SGC-7901和正常人胃粘膜上皮細(xì)胞GES-1，利用實(shí)時定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測miR-34a在胃癌細(xì)胞系和正常人胃粘膜上皮細(xì)胞GES-1中的表達(dá)情況；在胃癌細(xì)胞系HGC-27細(xì)胞中轉(zhuǎn)染mi

3、R-34a mimic，采用qRT-PCR方法檢測HGC-27細(xì)胞中miR-34a表達(dá)變化，以驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果；然后通過MTT法檢測miR-34a對胃癌細(xì)胞系HGC-27細(xì)胞的活力影響；流式細(xì)胞儀分析miR-34a對HGC-27細(xì)胞增殖的影響；采用Annexin V/PI雙染法分析miR-34a對HGC-27細(xì)胞凋亡的影響；采用transwell侵襲小室檢測miR-34a對HGC-27細(xì)胞遷移的影響；采用Western blot方法檢測mi

4、R-34a對細(xì)胞中survivin蛋白表達(dá)的影響。分別體外培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞系：SGC-7901和順鉑耐藥細(xì)胞株(SGC-7901/DDP)，采用qRT-PCR和Western blot檢測miR-34a、survivin在兩種胃癌細(xì)胞中的表達(dá)情況；在胃癌細(xì)胞SGC-7901和SGC-7901/DDP中轉(zhuǎn)染miR-34a mimic和miR-34a inhibitor后48h，采用qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中miR-34a的表達(dá)變化；采用

5、MTT檢測miR-34a的異位表達(dá)對順鉑誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞細(xì)胞活力的影響；采用Annexin V/PI雙染法，流式細(xì)胞儀分析miR-34a的異位表達(dá)對順鉑誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞凋亡的影響；應(yīng)用PI3K通路抑制劑Wortmannin進(jìn)行干預(yù)，然后采用Western blot方法和流式細(xì)胞儀檢測miR-34a異位表達(dá)對順鉑誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞中AKT和p-AKT表達(dá)的影響、以及對凋亡的影響。
　　結(jié)果：
　　qRT-PCR檢測結(jié)果顯示：與正常胃粘

6、膜上皮細(xì)胞GES-1相比，miR-34a在胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)顯著下降(p<0.01)；與對照組相比，在胃癌細(xì)胞HGC-27中轉(zhuǎn)染miR-34a mimic后48h，細(xì)胞中miR-34a的表達(dá)顯著上升(p<0.01)，提示miR-34a mimic轉(zhuǎn)染成功；MTT分析結(jié)果顯示：在胃癌細(xì)胞HGC-27中過表達(dá)miR-34a后，細(xì)胞活力明顯下降(p<0.05)；流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示：過表達(dá)miR-34a后，細(xì)胞的增殖指數(shù)明顯下降(p<0.0

7、5)；細(xì)胞的凋亡顯著增加(p<0.01)；transwell侵襲小室檢測結(jié)果顯示：增強(qiáng)miR-34a的表達(dá)后，穿過transwell小室的細(xì)胞數(shù)顯著降低(p<0.01)；Western blot檢測結(jié)果顯示：與對照組相比，在胃癌細(xì)胞HGC-27中轉(zhuǎn)染miR-34a mimic48h后，細(xì)胞中survivin蛋白的表達(dá)顯著下降(p<0.01)，即miR-34a與survivin蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。采用qRT-PCR和Western blo

8、t檢測結(jié)果顯示：與胃癌細(xì)胞SGC-7901相比，miR-34a在順鉑耐藥細(xì)胞株(SGC-7901/DDP)中的表達(dá)明顯下降(p<0.05)，而survivin的表達(dá)卻明顯上調(diào)(p<0.05)；與不經(jīng)過任何處理的SGC-7901細(xì)胞相比，在SGC-7901細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-34a mimic48h后，細(xì)胞中miR-34a的表達(dá)顯著上升(p<0.01)，轉(zhuǎn)染miR-34a inhibitor后，miR-34a的表達(dá)明顯下降(p<0.05)，

9、提示轉(zhuǎn)染效率高；MTT和流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示：在順鉑作用下的SGC-7901細(xì)胞中抑制miR-34a表達(dá)后，細(xì)胞活力明顯上升(p<0.05)，細(xì)胞凋亡數(shù)明顯減少(p<0.05)；而在順鉑作用下的SGC-7901細(xì)胞中過miR-34a表達(dá)后，細(xì)胞活力明顯下降(p<0.05)，細(xì)胞凋亡數(shù)明顯增加(p<0.05)，提示miR-34a與胃癌細(xì)胞順鉑化療的敏感性有關(guān)，即過表達(dá)miR-34a有助于提高胃癌細(xì)胞對順鉑化療的敏感性；Western b

10、lot和流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示：與不經(jīng)過任何處理的SGC-7901細(xì)胞相比，Wortmannin可明顯抑制miR-34a inhibitor和DDP誘導(dǎo)的p-AKT表達(dá)的升高(p<0.05)；促進(jìn)細(xì)胞凋亡(p<0.05)。
　　結(jié)論：
　　miR-34a在人胃癌細(xì)胞系中呈現(xiàn)出表達(dá)抑制，miR-34a可負(fù)性調(diào)節(jié)survivin蛋白的表達(dá)，并抑制胃癌細(xì)胞增殖和侵襲，促進(jìn)其凋亡，增強(qiáng)miR-34a表達(dá)或沉默survivin基因的治