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文檔簡介
1、背景:
乳腺癌作為女性惡性腫瘤中最常見的也是最具威脅力的惡性腫瘤,統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)顯示其全球發(fā)病率僅次于第一位的肺癌。隨著研究的深入,其治療方式越來越趨于多樣化,常見的有手術(shù)治療、放疔、化療、內(nèi)分泌治療、中醫(yī)針灸等。然而臨床上仍然有1/3的女性經(jīng)過治療后發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。研究人員指出,許多涉及調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展轉(zhuǎn)歸的基因與蛋白都參與了對腫瘤干細(xì)胞調(diào)控。其中,miR-34a是與乳腺癌密切相關(guān)的小分子RNA之一,它在乳腺癌的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)
2、移及凋亡等過程中均發(fā)揮了重要作用。MicroRNA-34a作為抑癌基因p53下游靶基因,它介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在腫瘤干細(xì)胞的自我更新中可能發(fā)揮重要作用,只有殺滅乳腺癌干細(xì)胞才能進(jìn)一步改善乳腺癌患者的預(yù)后。
DLL1(Delta-like1)蛋白作為Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中Notch1受體的配體,是單次跨膜糖蛋白,屬于DSL(Delta,Serrate,Lag-2)蛋白。Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的活化最早始于Notch配體結(jié)合到Notc
3、h受體,二者結(jié)合后經(jīng)過一系列生化反應(yīng)活化Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,各種不同組織及其細(xì)胞的正常的或異常的生長發(fā)育分化活動(dòng)都要受到該通路的調(diào)控。另有研究指出DLL1參與調(diào)控腫瘤的增殖、分化、凋亡、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等過程。Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作用非常廣泛,它不僅對胚胎及正常組織的生長發(fā)育至關(guān)重要,還是腫瘤干細(xì)胞中必不可少的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一。新近研究表明:Notch信號的表達(dá)增強(qiáng)增加了腫瘤細(xì)胞的增殖能力,活化Notch信號可以起到維持腫瘤干細(xì)胞,誘導(dǎo)
4、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等作用。Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的下游靶基因在該通路生物學(xué)特性的實(shí)現(xiàn)過程中扮演著重要角色,其中已知的靶基因包括:Hey、cyclin D1、Hes、NRARP、p21、pre-Tα、NF-κ B等。
目的:
探討MiR-34a對DLL1蛋白的調(diào)控作用,以及MiR-34a/DLL1與Notch信號通路和乳腺癌干細(xì)胞的作用,為乳腺癌的診斷和治療提供重要的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
方法:
1.將乳腺癌
5、細(xì)胞株MCF-7作為主要研究對象,采用免疫磁珠分選技術(shù)分選CD44+/CD24-乳腺癌干細(xì)胞,qRT-PCR,Western Blot技術(shù)檢測分選出的干細(xì)胞中MiR-34a和DLL1蛋白表達(dá)趨勢。
2.轉(zhuǎn)染miR-34a類似物和阻滯劑調(diào)節(jié)DLL1蛋白在MCF-7細(xì)胞株中的表達(dá)情況。qRT-PCR和Western Blot技術(shù)分別檢測MCF-7細(xì)胞內(nèi)DLL1 mRNA和DLL1蛋白的表達(dá)趨勢,Western Blot進(jìn)一步探索N
6、otch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游靶基因HEY1蛋白的表達(dá)、乳腺癌干細(xì)胞重要標(biāo)記物ALDH1表達(dá)以及凋亡相關(guān)的Caspase3蛋白的表達(dá)情況,探討miR-34a/DLL1蛋白對腫瘤及干細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制。
3.小RNA分子干擾技術(shù)構(gòu)造DLL1基因沉默的乳腺癌細(xì)胞系模型,通過qRT-PCR和Western Blot技術(shù)相繼檢測轉(zhuǎn)染后的沉默效率,確定DLL1基因被成功下調(diào),Western Blot技術(shù)檢測HEY1,Caspase3及AL
7、DH1蛋白的表達(dá),進(jìn)一步證明miR-34a通過調(diào)控DLL1蛋白實(shí)現(xiàn)其對Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及乳腺癌干細(xì)胞的調(diào)控。
4.最后采用CCK-8實(shí)驗(yàn)和Hochest33342染色驗(yàn)證miR-34a/DLL1對乳腺癌細(xì)胞的增殖和凋亡的影響。
結(jié)果:
1.分選CD44+/CD24-乳腺癌干細(xì)胞后,檢測發(fā)現(xiàn)乳腺癌干細(xì)胞中的miR-34a趨于低表達(dá)狀態(tài),而DLL1蛋白則趨于高表達(dá)。
2.通過轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)過表達(dá)/抑制
8、miR-34a后,Western Blot,qRT-PCR分別檢測DLL1蛋白表達(dá)水以及基因表達(dá)水平;Western Blot檢測HEY1,Caspase3,ALDH1蛋白表達(dá),結(jié)果顯示過表達(dá)miR-34a從轉(zhuǎn)錄水平抑制了DLL1蛋白表達(dá),HEY1蛋白、ALDH1與DLL1蛋白表達(dá)水平正相關(guān),而Caspase3表達(dá)水平與DLL1蛋白負(fù)相關(guān)。
3.小RNA干擾技術(shù)敲低DLL1基因表達(dá)后,Western Blot方法檢測HEY1,
9、Caspase3,ALDH1蛋白表達(dá)與miR-34a mimics轉(zhuǎn)染后的表達(dá)水平一致。
4.CCK-8法檢測DLL1蛋白對乳腺癌細(xì)胞增殖的影響結(jié)果顯示:與對照組相比,下調(diào)DLL1蛋白抑制了MCF-7細(xì)胞增殖,上調(diào)DLL1蛋白對細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用。Hochest33342染色結(jié)果表明下調(diào)DLL1蛋白后凋亡的細(xì)胞數(shù)增多。下調(diào)DLL1蛋白對細(xì)胞增殖的抑制作用可能是由于其誘導(dǎo)凋亡作用減少所致。
結(jié)論:
1.MiR
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