Notch配體Delta-like1、Delta-like4蛋白的表達及生物活性的測定.pdf

1、Notch信號途徑廣泛存在于多種生物體內(nèi)，且進化上高度保守，在胚胎發(fā)育、血細胞發(fā)育及腫瘤形成等多種病理生理過程中發(fā)揮重要作用。Notch信號在造血系統(tǒng)發(fā)育中起著十分重要的作用。近來發(fā)現(xiàn)，人造血干/祖細胞表面存在Notch受體的表達，而在骨髓基質(zhì)細胞表面存在多種Notch配體的表達，提示Notch信號途徑可能對造血干/祖細胞的自我更新與增殖起到重要作用。有研究表明Notch可以抑制造血干/祖細胞的分化,但促進其增殖。研究還發(fā)現(xiàn)，Notch

2、信號途徑能使共同淋巴樣前體細胞向T細胞方向分化，抑制向B細胞方向的分化；在外周脾臟B細胞發(fā)育中，Notch信號激活使其向邊緣帶B細胞方向分化。此外，Notch信號的失調(diào)與血液系統(tǒng)的許多腫瘤相關，Notch信號與T細胞的惡性轉(zhuǎn)化密切相關，Notch在其中起著癌基因的作用。
　　目前體外研究Notch信號對細胞增殖、分化和凋亡的作用多采用Notch配體刺激。Notch配體表達系統(tǒng)分真核表達系統(tǒng)和原核表達系統(tǒng)。真核表達絕大多數(shù)是哺乳動物

3、細胞系，如CHO，COS7等，但由于哺乳動物細胞表達系統(tǒng)成本高、難操作、表達水平低，限制其廣泛應用。而原核表達系統(tǒng)由于沒有翻譯后加工修飾系統(tǒng)，表達的真核細胞蛋白質(zhì)多以包涵體形式表達，復性純化方法復雜。而畢赤酵母表達系統(tǒng)兼有原核生物和真核生物的某些優(yōu)點：有翻譯后加工修飾系統(tǒng)，酵母能在簡單廉價的培養(yǎng)基中快速高密度地繁殖，產(chǎn)量高，成本低，可進行工業(yè)化生產(chǎn)。因此在選擇Notch配體的表達系統(tǒng)中我們首先選擇畢赤酵母，其次是原核表達系統(tǒng)，但需要實現(xiàn)

4、可溶性表達，以利于大規(guī)模應用。
　　我們主要進行了如下幾方面的研究：
　　1、畢赤酵母表達重組人Delta-like1ext-Fc（hDll1ext-Fc）蛋白。PCR法擴增hDll1ext片段,截取已有質(zhì)粒pET32a-Fc中Fc片段，構(gòu)建酵母表達載體pPIC9K-hDll1ext-Fc，和pPIC9K-Fc，經(jīng)過組氨酸營養(yǎng)缺陷，G418抗生素雙重篩選陽性轉(zhuǎn)化子，甲醇誘導表達。
　　2、重組hDll4的原核表達。構(gòu)建

5、原核表達載體pET32a-hdll4ext-26-217和pET32a-hdll4ext-93-217，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，IPTG，30℃低溫誘導表達，鎳離子螯合珠(InvitrogenProBondTM)一步純化上清。
　　3、重組hDll4蛋白生物學功能的檢測。通過報告基因?qū)嶒灆z測重組hDll4蛋白的生物學活性。
　　結(jié)論：實現(xiàn)了hDll1ext-Fc和人IgG1Fc片段的在畢赤酵母中的表達；25℃低溫誘導實現(xiàn)重組h