基因OLA1(Obg Like ATPase 1)的蛋白功能研究.pdf

1、研究背景：在真核細胞中，谷胱甘肽(Glutathione； GSH)是豐度最高的小分子肽。作為一種非常重要的非蛋白巰基分子，參與了一系列的細胞生理活動：其作為一種還原劑和抗氧化劑，參與了大量的細胞外源性和內(nèi)源性分子的生理代謝；作為一種自由基清除劑，因為活性氧(ROS)和活性氮自由基(RNS)在細胞信號傳導和許多病理發(fā)展過程中扮演了非常重要的角色，所以谷胱甘肽在含量與生理代謝上的改變被認為和很多疾病有聯(lián)系，包括腫瘤，神經(jīng)系統(tǒng)疾病，艾滋病，

2、衰老，囊性纖維化，肝病，心臟病，中風，糖尿病以及營養(yǎng)不良癥。
　　 為了進一步理解GSH的抗氧化調(diào)節(jié)及其對機體各種生理活動的影響，數(shù)年以前，我們實驗組成員施正政等人用遺傳學的方法在小鼠胚胎細胞中把谷氨酰半胱氨酸合成酶的重鏈基因敲除而得到自身不能合成GSH的小鼠胚胎，并把囊胚細胞分離出來進行體外培養(yǎng)。這些突變型的囊胚細胞在含有GSH或者N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine；NAC)的培養(yǎng)基中能夠正常生長和無限繁殖，但

3、是當GSH或者NAC沒有得到補充時，細胞都會死亡。用基因芯片的技術(shù)來研究GSH被剝奪之后突變型細胞內(nèi)基因表達的變化，結(jié)果分析顯示有32個基因有顯著的差異表達。按照生物學功能分類，這些基因的功能包括細胞周期調(diào)控，細胞凋亡調(diào)控，生理代謝調(diào)控以及未知功能。OLAl(Obg-like ATPase； GTPBP9； PTD004)就是這32個基因中的一個，而且目前生理學功能未知。
　　 研究內(nèi)容：
　　 而本文將對這個未知功能的

4、基因-OLAl(Obg-like ATPase； GTPBP9； PTD004)進行初步的研究，希望能了解該基因在細胞生理活動中的功能，并進一步理解該基因在GSH參與的細胞生長和抗氧化調(diào)節(jié)中的作用，從而增進我們對細胞內(nèi)抗氧化反應和腫瘤發(fā)生發(fā)展的了解，為治療和預防腫瘤提供新的思路和方法。研究內(nèi)容共分三部分：(一)蛋白結(jié)構(gòu)，表達與功能分析；(二)調(diào)控抗氧化機制研究；(三)在腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲中的作用。
　　 (一)蛋白結(jié)構(gòu)，表達與功能分

5、析
　　 我們通過生物信息學分析表明OLA1屬于Obg-類的GTPase家族，與P-IoopNTPase-YchF同源。其蛋白含有396個氨基酸，已知的結(jié)構(gòu)域有位于N端的Gdomain，其兩側(cè)有coiled-coil domain，還包括在C端的TGS domain。通過在GeneBank序列庫對比發(fā)現(xiàn)，OLAI基因和蛋白序列在酵母，小鼠和人類中的同源性極高，表明OLA1是相對保守的基因。我們用Westem blotting方法

6、在16中人類腫瘤和正常細胞系中檢測發(fā)現(xiàn)，OLAI是一個廣泛表達的基因，在多種腫瘤和正常細胞系中都有表達。我們通過免疫熒光的方法和在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)染GFP融合表達質(zhì)粒，在熒光顯微鏡下觀察到OLAI蛋白定位在胞漿。
　　 (二)調(diào)控抗氧化機制研究
　　 首先我們用siRNA轉(zhuǎn)染的方法來降低其在細胞內(nèi)的表達，并用Westem blotting方法來檢測其knockdown的效果，在轉(zhuǎn)染48小時后，與對照相比，knockdown細胞蛋

7、白水平下降80％以上。而且在用細胞計數(shù)，PI染色和Annexin V染色技術(shù)，發(fā)現(xiàn)knockdown細胞的細胞周期和增殖速率，死亡率和對照組細胞沒有差異。但是當加入氧化劑包括diamide-巰基氧化劑和tert-butyl hydroperoxide(tBH)-過氧化劑處理5小時后，用MTS方法來檢查細胞活力時，發(fā)現(xiàn)對照組細胞由于氧化壓力的原因開始出現(xiàn)大量死亡，而knockdown細胞的死亡率卻比較低，仍能維持相對正常的生理活動。另一方

8、面，當我們用質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染細胞使OLAI在細胞內(nèi)過表達后，過表達的細胞對這些氧化劑變得更敏感，更容易因氧化壓力而死亡。但是無論是OLA1低表達或過表達都沒有改變細胞對有線粒體毒性或DNA毒性的藥物的敏感性，包括antimycinA，etoposide，和doxorubincine，這說明OLA1對細胞的抗氧化能力的條件是有特異性的。
　　 當我們用H2DCFDA染色并通過流式細胞技術(shù)來觀測細胞內(nèi)的活性氧水平(ROS)，發(fā)現(xiàn)在加20

9、0μM tBH處理1小時，對照細胞中的ROS水平增加幅度顯著高于knockdown細胞(71.4％ vs.36％)，這表明OLA1-knockdown之后能抑制應激產(chǎn)生的大量ROS。當用bioluminescence-based assay來檢測細胞內(nèi)的GSH含量時，發(fā)現(xiàn)在400μM tBH或者400μM diamide處理1小時，knockdown細胞內(nèi)的GSH含量仍能保持在相對較高的水平。同時，我們用基因芯片的方法來研究knockd

10、own之后細胞內(nèi)基因表達的變化情況，結(jié)果顯示OLA1-knockdown所帶來的基因表達變化很小，在嚴格的統(tǒng)計學挑選條件下，共有13個基因發(fā)現(xiàn)表達有差異，而且目前的研究沒有發(fā)現(xiàn)這些基因和細胞抗氧化能力改變有直接的因果關(guān)系。而且當加入20μg/ml cycloheximide后，細胞內(nèi)的蛋白合成被阻止，但MTS檢測細胞活力顯示，相比對照組細胞，knockdown細胞仍表現(xiàn)出對這些氧化劑具有較高的抵抗力.這有力說明OLAI作為細胞抗氧化反應

11、的負調(diào)控因子，其作用機制是不依賴新的蛋白合成，而是對現(xiàn)存的蛋白的修飾，調(diào)節(jié)其功能來實現(xiàn)的。
　　 (三)在腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲中的作用
　　 ROS作為信號傳導的中介，參與了腫瘤轉(zhuǎn)移的多個環(huán)節(jié)包括腫瘤細胞遷移和侵入。而OLA1對細胞內(nèi)的ROS水平具有非常迅速的調(diào)節(jié)作用，所以很有可能通過調(diào)控ROS而參與了細胞轉(zhuǎn)移這個過程。在“創(chuàng)傷.愈合”實驗中發(fā)現(xiàn)，knockdown細胞的遷移速率大約只有對照細胞的55％，具有遷移細胞特征的細胞

12、數(shù)目比例減少到42％，而對照組細胞占78％，表現(xiàn)出遷移受阻的現(xiàn)象。Cell migration assay和cell invasion assay顯示，在人類乳腺癌細胞MBA-MD-231中，OLA1被knockdown后，細胞的遷移和侵入被抑制，分別下降了43％和78％。而且同時knockdown細胞內(nèi)應激產(chǎn)生的ROS水平被抑制。當我們用還原劑N-acetylcysteine5 mM處理細胞后發(fā)現(xiàn)，在“創(chuàng)傷-愈合”實驗中，無論是kno

13、ckdown細胞還是對照組細胞，“創(chuàng)傷”兩側(cè)細胞內(nèi)的ROS被顯著下調(diào)，同時兩組之間細胞的向“創(chuàng)傷”遷移的活動受阻。Cell invasion assay顯示，加入N-acetylcysteine后，knockdown細胞和對照組細胞侵入活動也被明顯的抑制，都只有原來的20％左右。這表明OLA1-knockdown后，對腫瘤細胞遷移和侵入能力的抑制很可能是通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的ROS水平來實現(xiàn)的。
　　 結(jié)論與創(chuàng)新：
　　 1.

14、本研究首次發(fā)現(xiàn)一個新的細胞內(nèi)抗氧化反應的負調(diào)控因子-OLA1，它對細胞內(nèi)抗氧化機制具有特異的調(diào)節(jié)性，主要是針對細胞內(nèi)的還原型巰基的動態(tài)平衡。
　　 2.本研究發(fā)現(xiàn)了新的抗氧化調(diào)節(jié)機制，證明OLA1對細胞抗氧化機制的調(diào)節(jié)是通過蛋白翻譯后調(diào)節(jié)來實現(xiàn)的，而不像大部分的調(diào)節(jié)途徑需要從基因轉(zhuǎn)錄開始，因而反應更迅速。
　　 3.本研究首次發(fā)現(xiàn)因為OLA1被knockdown之后，導致腫瘤細胞的遷移和侵入能力被抑制，轉(zhuǎn)移能力下降，并且