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文檔簡介
1、目的:
Weinberg等提出了腫瘤的幾個標(biāo)志性特征:自給自足的生長信號,抗增長抑制和細(xì)胞死亡的能力,血管生成和無限制自我復(fù)制能力,侵襲和轉(zhuǎn)移能力,逃避免疫殺傷,誘導(dǎo)炎癥發(fā)生,細(xì)胞能量異動以及基因組的不穩(wěn)定性和突變性。事實上,腫瘤細(xì)胞生存在一個動態(tài)變化中的微環(huán)境里面。腫瘤的快速生長能力會誘導(dǎo)大量的細(xì)胞內(nèi)來源或者細(xì)胞外來源的壓力的產(chǎn)生。當(dāng)腫瘤的生長速度超過血液供應(yīng)速度的時候,就會出現(xiàn)養(yǎng)料和氧氣匱乏的現(xiàn)狀。雖然腫瘤細(xì)胞對此具有一定
2、的耐受能力,但細(xì)胞內(nèi)的能量代謝會受到抑制,細(xì)胞可能因此死亡。缺氧會導(dǎo)致細(xì)胞核內(nèi)DNA降解,導(dǎo)致細(xì)胞壞死或凋亡的出現(xiàn)。應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生后,細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)會激活未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)從而減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負(fù)荷,持續(xù)性蛋白質(zhì)合成的抑制會造成細(xì)胞的生長停滯。一般情況下,癌細(xì)胞是處在氧化應(yīng)激環(huán)境下。過量的活性氧簇(ROS)的產(chǎn)生會引起細(xì)胞死亡。面對如此之多的各種不利的內(nèi)外壓力,腫瘤細(xì)胞已經(jīng)形成了一套稱之為整合應(yīng)激反應(yīng)(ISR)的應(yīng)激反應(yīng)系統(tǒng)。真核生物翻譯起始
3、因子2α(eIF2α)在整合應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。eIF2a的磷酸化會抑制蛋白質(zhì)合成,但同時也會增強(qiáng)了一些特殊蛋白的翻譯,如活化轉(zhuǎn)錄因子4(ATF4)。ATF4表達(dá)的上調(diào)將開啟整合應(yīng)激反應(yīng)系統(tǒng)中一系列基因的轉(zhuǎn)錄程序。比如天冬酰胺合成酶(ASNS)和轉(zhuǎn)錄因子C/EBP同源蛋白(CHOP)。整合應(yīng)激反應(yīng)有助于腫瘤細(xì)胞耐受各種壓力環(huán)境。與此同時,整合應(yīng)激反應(yīng)的持續(xù)活化又可以通過蛋白質(zhì)合成的抑制和細(xì)胞凋亡的激活造成細(xì)胞死亡。
OLA
4、1,Obg like ATPase1,被認(rèn)為在細(xì)胞蛋白質(zhì)翻譯和降解過程中發(fā)揮調(diào)控作用。但是,對其功能和相關(guān)機(jī)制的認(rèn)知甚少。在本文里面,我們提出OLA1是作為整合應(yīng)激反應(yīng)的一個新的調(diào)控因子,OLA1的表達(dá)對乳腺癌的發(fā)展具有重要作用。
方法和結(jié)果:
本位主要以乳腺癌細(xì)胞系231-D3H2-LN(MDA-MB-231-luc-D3H2LN)作為對象研究了OLA1蛋白對腫瘤生長轉(zhuǎn)移能力的影響以及OLA1在整合應(yīng)激反應(yīng)(ISR
5、)中的調(diào)控作用。研究內(nèi)容主要包括三個部分:(一)OLA1對腫瘤細(xì)胞體內(nèi)生長轉(zhuǎn)移的影響;(二)體外實驗研究OLA1對細(xì)胞壓力應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控以及OLA1的下游調(diào)控蛋白;(三)OLA1作為乳腺癌的一個預(yù)后指標(biāo)的可行性研究。
(一)OLA1對腫瘤細(xì)胞體內(nèi)生長轉(zhuǎn)移的影響
利用慢病毒感染構(gòu)建231-D3H2-LN OLA1表達(dá)敲低的穩(wěn)定細(xì)胞株以及對照組。將細(xì)胞等量注射到裸鼠脂肪墊。三周后, OLA1敲低表達(dá)腫瘤組生長速度明顯快于
6、對照組。有趣的是,體外實驗表明OLA1對腫瘤細(xì)胞生長的影響是很小的。第二次動物實驗中,我們在SCID小鼠的脂肪墊上接種231-D3H2-LN穩(wěn)定細(xì)胞株。IVIS(體內(nèi)成像系統(tǒng))結(jié)果發(fā)現(xiàn),OLA1敲低組中的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比率為84.6%(11/13),超過了對照組的38.5%(5/13)。組織病理學(xué)研究進(jìn)一步確認(rèn)小鼠淋巴結(jié)和肺的轉(zhuǎn)移情況。我們發(fā)現(xiàn),OLA1低表達(dá)組中發(fā)生了更多的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(20個,對照組9個)和肺轉(zhuǎn)移(6例,對照組2例)。OL
7、A1表達(dá)的下調(diào)會增強(qiáng)腫瘤轉(zhuǎn)移能力。Western blot研究腫瘤組織中的蛋白質(zhì)表達(dá)情況。我們發(fā)現(xiàn)在OLA1敲低腫瘤中,p-GSK-3β,p-p70S6K,p-eIF2α,ASNS和CHOP的表達(dá)下調(diào)。免疫組化染色證實了OLA1的下調(diào)會引起CHOP表達(dá)的降低以及細(xì)胞凋亡的減少。Ki67染色結(jié)果則顯示, OLA1的表達(dá)與對細(xì)胞增殖沒有影響。OLA1的抑制對乳腺癌細(xì)胞在體內(nèi)生長和轉(zhuǎn)移具有促進(jìn)作用,同時會影響腫瘤ISR通路中相關(guān)蛋白表達(dá)的變化
8、。
(二)體外實驗研究OLA1對細(xì)胞壓力應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控以及相關(guān)下游調(diào)控蛋白
為進(jìn)一步研究OLA1對腫瘤細(xì)胞整合應(yīng)激反應(yīng)的影響,體外實驗中我們對231-D3H2-LN穩(wěn)定細(xì)胞株進(jìn)行血清饑餓處理,氨基酸饑餓處理,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)處理(tunicamycin)或氧化應(yīng)激誘導(dǎo)處理(H2O2)。相比較對照組,OLA1表達(dá)敲低組細(xì)胞更能耐受各種壓力,細(xì)胞的存活比例也更高。Western blot結(jié)果表明,血清饑餓處理72小時后
9、,OLA1低表達(dá)組中,p-eIF2α和p-GSK-3β的水平顯著降低。在氨基酸饑餓條件下,OLA1敲低組中GCN2-p-eIF2α-ATF4表達(dá)水平明顯低于對照組。同樣的,在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激或氧化應(yīng)激條件下,OLA1低表達(dá)組里面觀察到下調(diào)的PERK-p-eIF2α-ATF4-ANSN。35S標(biāo)記方法是用來檢測細(xì)胞中蛋白質(zhì)的翻譯速率。在血清饑餓或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下,OLA1敲低231-D3H2-LN細(xì)胞株中蛋白合成水平顯著增高。以上結(jié)果表明,OL
10、A1的抑制會降低乳腺腫瘤細(xì)胞整合應(yīng)激反應(yīng)通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)并增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞在壓力條件下的生存能力。OLA1-rescue實驗進(jìn)一步驗證了這個觀點。在OLA1敲低表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞株中,我們利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法將OLA1表達(dá)上調(diào)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),OLA1表達(dá)的回升同時伴隨著整合應(yīng)激反應(yīng)通路中PERK-eIF2α-ATF4表達(dá)的上調(diào)。在進(jìn)一步的免疫共沉淀(IP)實驗中我們發(fā)現(xiàn),OLA1與eIF2α蛋白之間具有直接的相互作用。
?。ㄈ㎡LA1作
11、為乳腺癌的一個預(yù)后指標(biāo)的可行性研究
采用免疫組織化學(xué)方法對160例乳腺癌臨床標(biāo)本進(jìn)行了OLA1蛋白表達(dá)情況的檢測,結(jié)合臨床病理資料及隨訪情況分析。Kaplan-Meier生存曲線表明,OLA1的低表達(dá)組中乳腺癌的復(fù)發(fā)時間更早(log-rank: P=0.024),乳腺癌患者術(shù)后生存更差(log-rank: P=0.033)。多因素Cox比例風(fēng)險模型分析表明,OLA1的表達(dá)水平和乳腺癌的復(fù)發(fā)風(fēng)險(HR:0.540,95%CI:0
12、.345-0.844,P=0.007),乳腺癌患者的術(shù)后死亡風(fēng)險(HR:0.514,95%CI:0.292-0.905,P=0.021)均呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系。OLA1的低表達(dá)預(yù)測預(yù)后不良的乳腺癌患者。
結(jié)論:
截止到現(xiàn)今,關(guān)于OLA1機(jī)制的研究少之又少,其中多數(shù)集中在原核生物中。實際上,OLA1的表達(dá)對真核生物,對腫瘤細(xì)胞的內(nèi)部各種機(jī)理的調(diào)控是極為重要的。OLA1不僅會影響細(xì)胞內(nèi)蛋白合成,還會調(diào)控腫瘤細(xì)胞內(nèi)整合應(yīng)激反應(yīng)(
13、ISR)信號通路的改變。
1.本文第一次提出了OLA1作為腫瘤細(xì)胞整合應(yīng)激反應(yīng)的潛在的一個調(diào)控因子。OLA1的敲低會引起腫瘤細(xì)胞中ISR通路中相關(guān)蛋白的下調(diào),同時提高細(xì)胞對體外各種壓力刺激的耐受能力和生存能力。進(jìn)一步的,細(xì)胞內(nèi)OLA1和eIF2α蛋白是直接互相結(jié)合的,提示了OLA1是如何影響ISR通路的變化。
2.本文第一次檢測了OLA1對乳腺癌細(xì)胞在小鼠體內(nèi)生存和轉(zhuǎn)移能力的影響。OLA1對腫瘤細(xì)胞在體外生長的影響不
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