氧化應(yīng)激反應(yīng)因子OLA1作為抗腫瘤藥靶的分子生物學(xué)研究.pdf

1、癌癥的致命性不僅歸咎于原發(fā)性腫瘤，而更因為轉(zhuǎn)移的發(fā)生。目前針對晚期患者的治療并不十分有效，至多能略微延長存活期。為了顯著降低癌癥的死亡率，有必要研發(fā)新的、同時針對原發(fā)和轉(zhuǎn)移腫瘤抗癌療法。旨在建立這樣一種抗癌機制，本項目推薦將OLA1(Obg-like ATPase)，一個我們近年來發(fā)現(xiàn)并致力研究的細胞應(yīng)激蛋白，作為新的藥物靶點。OLA1是普遍表達于細胞漿中的屬于Obg家族的ATP水解酶(ATPase)。Obg族類的ATPase在進化中高

2、度保守，見于從細菌到人的所有生物中，它們的具體生物學(xué)功用卻鮮為人知。在現(xiàn)有的文獻資料中除了本研究小組發(fā)表的論文外，只有個別的針對人類OLA1的研究。我們于2009年首先闡明OLA1是一個與氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)的內(nèi)源性負性調(diào)控因子。用RNA干擾技術(shù)降低OLA1的表達(knockdown)，細胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)會由于一些轉(zhuǎn)錄后的機理被加強。隨后我們又發(fā)現(xiàn)，如果腫瘤細胞的OLA1被knockdown，它們的體外遷移和侵入性能即會被顯著削弱。由此我們

3、設(shè)想，是否可以應(yīng)用下調(diào)OLA1所產(chǎn)生的有利效應(yīng)，研討針對OLA1設(shè)計抗腫瘤轉(zhuǎn)移治療的可行性。因為基因剔除(knockout)小鼠是現(xiàn)今研究基因體內(nèi)功能最為可靠的動物模型。并且在藥物靶鑒定(target validation)的領(lǐng)域中，分析knockout小鼠的表型是為模擬該藥物靶被完全抑制后全身反應(yīng)(包括正性的期望療效和負性的毒性作用)的首選程序，我們在本項目中引進了knockout小鼠模型，并對其開展了表型研究。這是本項目的設(shè)計思路之

4、一。本項目的另外一個重要目的是要進一步闡明OLA1作用的分子生物學(xué)機理。雖然我們的前期研究指向OLA1對細胞氧化還原平衡(redox equilibrium)的影響，但是沒有找到它作用的代謝通道(pathway)。我們意外地發(fā)現(xiàn)，OLA1可能是一種特殊的蛋白質(zhì)翻譯后修飾機制(PTM)的調(diào)節(jié)因子，它負性地調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)S-谷胱甘肽修飾(S-glutathionylation)。S-glutathionylation是蛋白質(zhì)中半胱氨酸上的巰基(

5、-SH)與胞漿中氧化型谷胱甘肽(GSH)通過巰基.硫醚交換形成的混合型二硫鍵(P-SSG)，可逆性地發(fā)生于高氧脅迫(oxidative stress)狀態(tài)并存在于非脅迫的基線狀態(tài)。S-glutathionylation與另一種著名的PMT，蛋白質(zhì)磷酸化(proteinphosphorylation)在原理上很相象，有人推斷，S-glutathionylation是與蛋白質(zhì)磷酸化平行，并交互影響的一種重要的蛋白質(zhì)活性調(diào)控和信號傳導(dǎo)機制。但

6、是由于缺乏對該通道上游調(diào)控因子的定位分析，該領(lǐng)域只限制于小規(guī)模的研究，未得到應(yīng)有的重視。我們認為，如果OLA1對S-glutathionylation的調(diào)節(jié)功能能被肯定，其結(jié)果將不僅有助于演繹OLA1的應(yīng)用價值，比如作為抗腫瘤的藥物靶，而且將促進有關(guān)PTM基本生物學(xué)現(xiàn)象的基礎(chǔ)研究。因此，沿著這一研究方向，進行了細致的分子生物學(xué)論證。
　　 本研究主要內(nèi)容包括：⑴體內(nèi)Ola1 knockout研究：為了深入闡明OLA1的體內(nèi)生物學(xué)

7、功能，我們建立了一株knockout小鼠，其中的Ola1基因因被逆病毒載體的插入而滅活。發(fā)現(xiàn)～85％的純合子(-/-)小鼠在圍產(chǎn)期階段死亡。但是幸存的-/-小鼠可以到成年，沒有表現(xiàn)顯著的健康問題，但是個體比野生型(+/+)和雜合型(+/-)小鼠持續(xù)小20-30％。胚胎研究發(fā)現(xiàn)，這一生長遲緩現(xiàn)象最早發(fā)生于胚胎發(fā)育的第10.5天，圍產(chǎn)期死亡的原因是肺部發(fā)育不全。我們采取了小鼠胚胎纖維母細胞(MEF)進行體外原代培養(yǎng)，也發(fā)現(xiàn)-/-MEF有生長

8、減緩和細胞周期阻滯。這些結(jié)果表明OLA1是維持體內(nèi)細胞產(chǎn)前產(chǎn)后正常生長的重要基因。但是OLA1的整體缺失，并不造成發(fā)育缺陷和幸存成年鼠的健康問題。⑵OLA1作為抗腫瘤藥物靶的體外研究：我們既往的研究發(fā)現(xiàn)，OLA1的knockdown會造成體外培養(yǎng)的人乳癌細胞MDA-MB-231的遷移和侵入滯緩。在本研究中，我們進一步發(fā)現(xiàn)，OLA1 knockdown導(dǎo)致乳癌細胞對Anoikis(貼附失缺性調(diào)亡)的敏感性顯著增高。最后，應(yīng)用穩(wěn)定性RNA干

9、擾技術(shù)，我們證實OLA1knockdown會造成MDA-MB-231穩(wěn)定細胞株的生長速度減緩，與上述體內(nèi)的knockout結(jié)果對應(yīng)一致。綜合我們既往的和現(xiàn)在的發(fā)現(xiàn)，對OLA1的靶向滅活至少會獲得如下4項對抑制腫瘤惡性表型有利的效果：(1)↓腫瘤細胞生長，(2)↓遷移，(3)↓侵入，以及(4)↑Anoikis。因此我們推薦OLA1可作為抗腫瘤或抗腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物靶，進入下一階段的體內(nèi)target validation的研究。⑶OLA1作為S

10、-glutathionylation調(diào)節(jié)因子的分子機理研究：應(yīng)用針對P-SSG的特殊Western blot和Slot blot技術(shù)，發(fā)現(xiàn)，在OLA1 knockdown的多種體外培養(yǎng)人類細胞中，細胞骨架蛋白actin和諸多其他蛋白具有顯著增高的基線水平P-SSG。OLA1水平與整體(globe)P-SSG的負相關(guān)性也顯現(xiàn)于經(jīng)受氧化劑刺激(雙氧水和巰基氧化劑diamide)的細胞中。這一規(guī)律也在原代培養(yǎng)的剛從體內(nèi)制備的Ola1-/-ME

11、F中被證實。我們推斷，OLA1對S-glutathionylation調(diào)節(jié)功能是通過其調(diào)控直接參與S-glutathionylation加成的酶類比如GSTπ(谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶)的穩(wěn)定性。OLA1與GSTπ的結(jié)合反應(yīng)也已被初步證實。根據(jù)這些結(jié)果，我們提出OLA1其實是先前尚未發(fā)現(xiàn)的S-glutathionylation上游調(diào)控因子之一。
　　 本研究的結(jié)論與創(chuàng)新：①本研究發(fā)現(xiàn)OLA1，一個首先由我們發(fā)現(xiàn)的新的氧化應(yīng)激反應(yīng)因子，