菜蛾盤絨繭蜂多分DNA病毒（CvBV）EP-1 like基因家族序列分析及EP-1 like 1基因表達(dá)研究.pdf

1、多分DNA病毒(polydnavirus，PDV)是一類與寄生蜂有專性互惠共生關(guān)系的特殊昆蟲(chóng)病毒，其基因的表達(dá)對(duì)抑制寄主免疫反應(yīng)、保證寄生蜂卵發(fā)育有重要作用。EP基因家族是繭蜂科昆蟲(chóng)所擁有的PDV(繭蜂病毒Bracovirus，BV)的一個(gè)重要基因家族，具有重要的生理作用。本研究測(cè)定了菜蛾盤絨繭蜂病毒Cotesia vestalis bracovirus(CvBV)EP-1 like基因家族7個(gè)基因的cDNA全序列，并進(jìn)行了序列分析。在

2、此基礎(chǔ)上，將EP-1 like 1(EPL-1)基因與原核表達(dá)載體pET-28a和pET-30a連接，從而構(gòu)建、篩選了高效表達(dá)重組載體pET28-EPL-1，并在大腸桿菌中表達(dá)了EPL-1融合蛋白。采用傳統(tǒng)割膠回收的方法回收純化表達(dá)蛋白，并將純化后的蛋白免疫新西蘭大耳兔，制備了抗EPL-1多克隆抗體；以此多克隆抗體為基礎(chǔ)研究了EPL-1基因在被寄生后寄主小菜蛾P(guān)lutella xylostella幼蟲(chóng)體內(nèi)的蛋白含量變化；最后利用熒光定量

3、PCR分析了EPL-1基因在寄主小菜蛾體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄動(dòng)態(tài)。 本研究的主要結(jié)果如下： (1)應(yīng)用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(RACE)的方法獲得了EP-1 like基因家族7個(gè)基因的cDNA序列全長(zhǎng)，相關(guān)推導(dǎo)蛋白氨基酸序列的翻譯后加工和信號(hào)肽的預(yù)測(cè)分別采用網(wǎng)上搜索工具EXPASY和SignalP軟件，發(fā)現(xiàn)CvBV編碼的EP-1 like蛋白中雖然不存在保守功能域但N端都具有一個(gè)信號(hào)肽編碼序列和眾多的理論蛋白質(zhì)修飾和功能位點(diǎn)。在利

4、用BLASTP搜索獲得同源蛋白后構(gòu)建了以氨基酸序列為基礎(chǔ)的進(jìn)化樹(shù)，由此發(fā)現(xiàn)CvBV編碼的該基因家族成員之間關(guān)系并不密切，同時(shí)整個(gè)PDV編碼的該基因家族成員之間可以劃分成4個(gè)類群，其中EPL-1和EPL-2，EPL-3和EPL-4分別處于同一類群，但它們位于不同分支上。另外，EPL-5和CcBV early-expressed蛋白處于同一類群；EPL-7與部分GiBV和CcBV蛋白處于同一類群。 (2)將PCR擴(kuò)增得到EPL-1基

5、因ORF(921bp)克隆到表達(dá)載體pET-28a和pET-30a中，構(gòu)建并篩選了高效表達(dá)重組載體pET28-EPL-1，在IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)的情況下，正確表達(dá)了分子量為34.8kDa的重組融合蛋白。在大量表達(dá)EPL-1蛋白的基礎(chǔ)上，通過(guò)傳統(tǒng)割膠回收、電透析的方法純化表達(dá)蛋白并免疫新西蘭大耳兔，制備了抗EPL-1蛋白的多克隆抗體(效價(jià)1：128,000)，同時(shí)用Western Blot檢測(cè)了抗體的特異性。 (3)以制備的抗EPL-

6、1多克隆抗體為一抗，間接ELISA法檢測(cè)小菜蛾幼蟲(chóng)體內(nèi)EPL-1蛋白含量變化。結(jié)果表明在被寄生的小菜蛾幼蟲(chóng)血漿和血細(xì)胞內(nèi)EPL-1蛋白的含量都隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，在寄生后第6天達(dá)到峰值。 (4)利用熒光定量PCR分析了CvBVEPL-1基因在寄主小菜蛾體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄動(dòng)態(tài)，發(fā)現(xiàn)在被寄生6天內(nèi)的小菜蛾幼蟲(chóng)體內(nèi)都可以檢測(cè)到EPL-1基因的轉(zhuǎn)錄，但是在寄生后寄主體內(nèi)EPL-1基因的轉(zhuǎn)錄出現(xiàn)了2次轉(zhuǎn)錄高峰(2 d p.p.和5 d p.p.)；具體至

7、寄生后寄主的腦、血淋巴和中腸時(shí)又發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)錄模式各不相同：在寄生后2h就能檢測(cè)到該基因在寄主腦組織內(nèi)的轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄高峰出現(xiàn)在12 hp.p.，此后轉(zhuǎn)錄水平迅速降低；在寄生后6h就能檢測(cè)到該基因在寄主中腸中的轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄高峰出現(xiàn)在12 hp.p.，此后轉(zhuǎn)錄水平逐漸減低；在寄生后12h就能檢測(cè)到該基因在寄主血淋巴中的轉(zhuǎn)錄，同時(shí)轉(zhuǎn)錄水平在寄生后的6d內(nèi)持續(xù)上升。所以EPL-1基因在小菜蛾幼蟲(chóng)血淋巴內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平是隨著寄生后時(shí)間的延長(zhǎng)而提高，這與EPL