菜蛾盤絨繭蜂畸形細胞肽聚糖識別蛋白和抗菌肽基因的克隆與功能初探.pdf

1、寄生蜂利用多種寄生因子對寄主的免疫系統(tǒng)、生長發(fā)育及營養(yǎng)代謝進行調(diào)控，為幼蜂提供良好的生長發(fā)育環(huán)境。作為主要寄生因子之一的畸形細胞，來源于寄生蜂胚胎的漿膜層細胞，幼蜂孵化時被釋放到寄主血腔中，在調(diào)控寄主生長發(fā)育和營養(yǎng)代謝等生理過程中發(fā)揮了重要作用?？咕氖抢ハx先天免疫系統(tǒng)中非常重要的一類效應(yīng)分子，是昆蟲受到外界微生物侵害時，昆蟲體內(nèi)一些組織或器官中大量迅速合成并釋放出具有生物活性的物質(zhì)，能殺死細菌、真菌、病毒甚至腫瘤細胞。本論文首先在篩選

2、出18個菜蛾盤絨繭蜂畸形細胞免疫相關(guān)基因EST序列的基礎(chǔ)上，克隆了其中6個免疫相關(guān)基因，并測定了它們在不同微生物誘導(dǎo)下的轉(zhuǎn)錄模式;其次，對菜蛾盤絨繭蜂畸形細胞所產(chǎn)生抗菌肽的抑菌活性以及畸形細胞與寄主感菌后死亡率的關(guān)系進行了初步研究?，F(xiàn)將研究結(jié)果總結(jié)如下:
　　(1)免疫相關(guān)基因的篩選與驗證
　　根據(jù)菜蛾盤絨繭蜂畸形細胞轉(zhuǎn)錄組中基因注釋的結(jié)果，結(jié)合生物信息學(xué)分析，篩選出可以匹配到已知的10個免疫相關(guān)基因家族的18個EST序列。

3、通過反轉(zhuǎn)錄PCR(RT—PCR)驗證了其中包括防御素defensin、溶菌酶lysozyme、膜翅肽hymenoptaecin、肽聚糖識別蛋白peptidoglycan-recognition protein(PGRP)等在內(nèi)的15個基因。
　　(2)菜蛾盤絨繭蜂畸形細胞肽聚糖識別蛋白和抗菌肽基因的克隆與序列分析
　　通過RACE等技術(shù)手段，獲得了包括菜蛾盤絨繭蜂畸形細胞防御素(CvTdef)、菜蛾盤絨繭蜂畸形細胞肽聚糖識別

4、蛋白(CvTpgrp)和菜蛾盤絨繭蜂畸形細胞甲殼肽（CvTcru）在內(nèi)的3種免疫相關(guān)基因家族的6條cDNA全長序列。其中，CvTdef-A含有長度為369bp的開放閱讀框(ORF)，編碼1個123個氨基酸殘基的蛋白，預(yù)測分子量大約為13.25kDa;CvTdef-B含有長度為222bp的開放閱讀框，編碼1個74個氨基酸殘基的蛋白，預(yù)測分子量大約為7.97kDa; CvTdef-C含有長度為237bp的開放閱讀框，編碼1個79個氨基酸殘基

5、的蛋白，預(yù)測分子量大約為8.56kDa; CvTpgrp-SA含有長度為336bp的開放閱讀框，編碼1個112個氨基酸殘基的蛋白，預(yù)測分子量大約為12.69kDa; CvTpgrp-LC含有長度為525bp的開放閱讀框，編碼1個175個氨基酸殘基的蛋白，預(yù)測分子量大約為35.29kDa;CvTcru含有長度為426bp的開放閱讀框，編碼1個142個氨基酸殘基的蛋白，預(yù)測分子量大約為16.39kDa。序列分析結(jié)果表明:CvTdef-A、C

6、vTdef-B、CvTdef-C均含有信號肽序列和6個保守的半胱氨酸位點。
　　(3)微生物誘導(dǎo)下菜蛾盤絨繭蜂畸形細胞肽聚糖識別蛋白和抗菌肽基因的轉(zhuǎn)錄模式
　　在菜蛾盤絨繭蜂畸形細胞體外培養(yǎng)的體系中加入熱滅活的大腸桿菌Escherichia coli、枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis和白色念珠菌Monilia albican進行體外免疫誘導(dǎo)。誘導(dǎo)6h、12h、24h、48h后提取各種處理條件下畸形細胞的總RNA

7、并合成cDNA，以熒光定量PCR(qRT-PCR)的方法檢測CvTdef、 CvTpgrp和CvTcru的轉(zhuǎn)錄水平。經(jīng)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌誘導(dǎo)處理后，6個基因的轉(zhuǎn)錄水平明顯地提高并隨著誘導(dǎo)時間的延長而繼續(xù)上升，而這種轉(zhuǎn)錄水平上升的幅度是誘導(dǎo)早期高于誘導(dǎo)晚期。不同菜蛾盤絨繭蜂畸形細胞肽聚糖識別蛋白和抗菌肽基因的轉(zhuǎn)錄水平與不同微生物誘導(dǎo)的相關(guān)性不同:CvTde-A、CvTde-B、CvTde-C和CvTpgrp-SA經(jīng)細菌誘導(dǎo)

8、后轉(zhuǎn)錄水平均顯著高于真菌誘導(dǎo)后的轉(zhuǎn)錄水平，CvTpgrp-LC在細菌、真菌誘導(dǎo)后轉(zhuǎn)錄水平較為接近;CvTcru經(jīng)革蘭氏陽性菌誘導(dǎo)后的轉(zhuǎn)錄量上升水平高于革蘭氏陰性菌和真菌誘導(dǎo)。比較3個CvTdef在不同微生物誘導(dǎo)后的轉(zhuǎn)錄水平，從高到低依次為CvTdef-C＞CvTdef-B＞ CvTdef-A。CvTpgrp-LC在3種微生物誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄水平均高于CvTpgrp-SA。
　　(4) CvTdef-A的抑菌活性及畸形細胞與寄主幼蟲感菌后

9、死亡率的關(guān)系初探
　　以菌液生長曲線測定法測定了人工合成的CvTdef-A多肽的抑菌活性，結(jié)果表明CvTdef-A多肽對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的生長都具有抑制作用，且對于大腸桿菌生長的抑制作用強于對枯草芽孢桿菌生長的抑制作用。
　　通過比較菜蛾盤絨繭蜂雌蜂正常寄生、輻射不育菜蛾盤絨繭蜂雌蜂假寄生和未寄生的小菜蛾3齡中期幼蟲在大腸桿菌、銅綠假單胞桿菌Pseudomonas aeruginosa、、金黃色葡萄球菌Staphylo