甲狀旁腺素相關(guān)蛋白1-141和1-86的表達(dá)與生物活性測定.pdf

1、　　本實驗采用TKM法自人血細(xì)胞中提取基因組DNA，并以之為模板PCR擴(kuò)增hPTHrP1-141編碼基因。將該基因克隆入pGEM-Teasy載體，并進(jìn)行DNA序列分析。在此基礎(chǔ)上，將編碼hPTHrP1-141和hPTHrP1-86的基因片段分別克隆到表達(dá)載體pQE-30Xa上，并轉(zhuǎn)化入E.coliM15[pREP4]，進(jìn)行融合表達(dá)。表達(dá)條件經(jīng)優(yōu)化后，rhPTHrP1-141和rhPTHrP1-86的表達(dá)量分別達(dá)到60mg/L培養(yǎng)基和4m

2、g/L培養(yǎng)基。重組蛋白rhPTHrP1-141和rhPTHrP1-86分別占菌體可溶性蛋白的34.64％和6.38％。目的蛋白含6×His純化標(biāo)簽，可以經(jīng)金屬螯合親和層析吸附于Ni-NTA樹脂層析柱，梯度增加沖洗液中咪唑濃度以除去非特異吸附的雜蛋白后，將目的蛋白洗脫，超濾離心法濃縮。體外培養(yǎng)大鼠骨肉瘤細(xì)胞系UMR106，以rhPTH1-34標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對照，將PTHrP1-141和PTHrP1-86加入細(xì)胞培養(yǎng)液，使其終濃度分別為10

3、-10mol/L、10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L和10-5mol/L。PTHrP能與存在于UMR106細(xì)胞膜上的與G蛋白相偶連的PTH1型受體(PTH1R)結(jié)合，激活腺苷酸環(huán)化酶，使細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度升高。收集UMR106細(xì)胞裂解液，通過高效液相色譜檢測細(xì)胞裂解液中的cAMP的含量，可知PTHrP1-141和PTHrP1-86具有生物活性。隨濃度的升高，PTHrP1-141和PTHrP1-