蘇云金桿菌Enhancin-like蛋白的鑒定及增效作用分析.pdf

1、病毒增效蛋白是金屬蛋白酶,能夠特異性降解昆蟲(chóng)腸粘蛋白(IIM),從而增強(qiáng)病毒或是Bt殺蟲(chóng)晶體蛋白對(duì)昆蟲(chóng)的感染。蠟狀芽孢桿菌組發(fā)現(xiàn)了芽孢桿菌屬的基因組中含有enhancin—like基因,它編碼的肽段與病毒的增效蛋白相似性為20％～30％,研究發(fā)現(xiàn)蘇云金桿菌BMB171中的:Enhancin-like蛋白能夠降解棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)的腸粘蛋白從而增強(qiáng)cry1Ac蛋白對(duì)棉鈴蟲(chóng)的毒性,與病毒增效蛋白的作用相似。細(xì)菌中Enhancin-like蛋白的增效

2、作用是否具有廣譜性尚不明確。
　　 本研究從實(shí)驗(yàn)室保存的Bt菌株中篩選并成功克隆得到enhancin-like基因,提交GenBank登記,登錄號(hào)為JF806504。該基因讀碼框?yàn)?202個(gè)堿基,編碼733個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)的分子量為84kDa。Blastn結(jié)果發(fā)現(xiàn)其與病毒增效蛋白的相似性為22％～25％,與細(xì)菌增效蛋白的相似性為96～100％,并且具有保守鋅結(jié)合結(jié)構(gòu)域(HEIAH),屬于金屬蛋白酶超家族成員。
　　

3、 將重組表達(dá)質(zhì)粒pET30a-enhancin-like轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3),經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,SDS-PAGE檢測(cè),enhancin—like基因在E.coli BL21(DE3)成功表達(dá)84 kDa的蛋白,再將enhancin-like基因連接到穿梭載體pSXY422b,電激轉(zhuǎn)化HD73-(cry-),構(gòu)建工程菌,Western blot分析表明,enhancin-like基因能在HD73-(cry-)中穩(wěn)定表達(dá)。<

4、br>　　 利用親和層析的方法得到純化的Enhancin-like蛋白。純化的Enhancin-like蛋白體外處理粉紋夜蛾和甜菜夜蛾圍食膜,圍食膜腸粘蛋白未降解。生物活性測(cè)定純化的Enhancin-like蛋白與Cry9Ea蛋白共同飼喂粉紋夜蛾幼蟲(chóng),與單獨(dú)用Cry9Ea蛋白飼喂粉紋夜蛾時(shí),死亡率均為60％,而Enhancin與Cry9Ea蛋白共同飼喂粉紋夜蛾時(shí)死亡率顯著提高達(dá)到100％,Enhancin-like蛋白單獨(dú)飼喂時(shí)無(wú)殺蟲(chóng)