microRNa-34a調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化在血管損傷修復(fù)及重塑中的作用及機(jī)制.pdf

1、以動脈粥樣硬化為基本組織病理改變的血管病變發(fā)生發(fā)展導(dǎo)致血管重塑和管腔狹窄過程中，血管穩(wěn)態(tài)的破壞、損傷修復(fù)失衡是最基本的特征。血管平滑肌細(xì)胞通過干/祖細(xì)胞分化及本身表型轉(zhuǎn)化參與血管損傷修復(fù)及病理性重塑。我們課題組既往研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)microRNA-34a(miR-34a)可促進(jìn)胚胎干細(xì)胞分化為血管平滑肌細(xì)胞，然而對miR-34a是否調(diào)控成熟血管平滑肌細(xì)胞功能和血管病理重塑仍然知之甚少。
　　目的;
　　本研究希望闡述miR-34

2、a對血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化后增殖遷移功能以及血管損傷后新生內(nèi)膜形成的作用，并鑒定miR-34a靶基因，闡明其作用機(jī)制。
　　方法:
　　本研究分離小鼠原代血管平滑肌細(xì)胞體外培養(yǎng)，利用體外平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化模型，觀察miR-34a表達(dá)變化，并過表達(dá)或抑制miR-34a，研究miR-34a對血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移能力的影響。其次，利用生物信息學(xué)分析、分子克隆等方法鑒定miR-34a的功能性靶基因。最后，建立小鼠股動脈導(dǎo)絲損傷內(nèi)

3、膜病理性增生模型，在損傷血管局部過表達(dá)miR-34a，研究miR-34a對血管損傷后內(nèi)膜新生的作用。
　　結(jié)果:
　　原代血管平滑肌細(xì)胞經(jīng)歷血清饑餓，F(xiàn)BS、PDGF-BB、ox-LDL刺激后表型由“收縮型”向“增殖遷移型”轉(zhuǎn)化，在此過程中miR-34a表達(dá)顯著下降。功能研究中，細(xì)胞計數(shù)和BrdU實驗發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-34a抑制FBS、PDGF-BB誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞增殖，劃痕實驗和Transwell實驗則表明過表達(dá)miR-3

4、4a減弱平滑肌細(xì)胞遷移能力，反之抑制miR-34a表達(dá)可增加平滑肌細(xì)胞增殖、遷移能力。多個miRNA的生物信息學(xué)分析數(shù)據(jù)庫和RNA結(jié)構(gòu)分析軟件預(yù)測Notch1是miR-34a的靶基因。平滑肌細(xì)胞中過表達(dá)miR-34a在mRNA和蛋白水平下調(diào)Notch1表達(dá)，而抑制miR-34a則Notch1表達(dá)升高。分子克隆和熒光素酶報告實驗表明，miR-34a高表達(dá)能顯著降低Notch13'UTR調(diào)控的熒光素酶活性，而對Notch13'UTR中miR

5、-34a結(jié)合位點進(jìn)行突變后，miR-34a對熒光素酶活性的抑制作用被消除。miR-34a和Notch1過表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，發(fā)現(xiàn)miR-34a抑制平滑肌細(xì)胞增殖、遷移，而同時高表達(dá)Notch1可消除miR-34a的作用。成功建立小鼠股動脈導(dǎo)絲損傷內(nèi)膜增生模型，發(fā)現(xiàn)miR-34a在血管損傷后內(nèi)膜增生過程中顯著下降，損傷血管局部高表達(dá)miR-34a可明顯減輕血管損傷后內(nèi)膜新生。此外，miR-34a高表達(dá)減弱Notch1在血管中表達(dá)，減少血管新生

6、內(nèi)膜中PCNA陽性細(xì)胞比例，從體內(nèi)實驗層面驗證了miR-34a下調(diào)Notch1抑制平滑肌細(xì)胞增殖。
　　結(jié)論:
　　本研究成功揭示了miR-34a在血管平滑肌細(xì)胞中的新功能。miR-34a抑制血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化后的增殖及遷移能力。Notch1是miR-34a的功能性靶基因，miR-34a直接結(jié)合Notch1 mRNA的3'UTR，下調(diào)Notch1表達(dá)，并通過調(diào)控Notch1影響平滑肌細(xì)胞功能。在血管損傷內(nèi)膜病理性增生過程