microRNa-34a調控血管平滑肌細胞表型轉化在血管損傷修復及重塑中的作用及機制.pdf

1、以動脈粥樣硬化為基本組織病理改變的血管病變發(fā)生發(fā)展導致血管重塑和管腔狹窄過程中，血管穩(wěn)態(tài)的破壞、損傷修復失衡是最基本的特征。血管平滑肌細胞通過干/祖細胞分化及本身表型轉化參與血管損傷修復及病理性重塑。我們課題組既往研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)microRNA-34a(miR-34a)可促進胚胎干細胞分化為血管平滑肌細胞，然而對miR-34a是否調控成熟血管平滑肌細胞功能和血管病理重塑仍然知之甚少。
　　目的;
　　本研究希望闡述miR-34

2、a對血管平滑肌細胞表型轉化后增殖遷移功能以及血管損傷后新生內膜形成的作用，并鑒定miR-34a靶基因，闡明其作用機制。
　　方法:
　　本研究分離小鼠原代血管平滑肌細胞體外培養(yǎng)，利用體外平滑肌細胞表型轉化模型，觀察miR-34a表達變化，并過表達或抑制miR-34a，研究miR-34a對血管平滑肌細胞增殖、遷移能力的影響。其次，利用生物信息學分析、分子克隆等方法鑒定miR-34a的功能性靶基因。最后，建立小鼠股動脈導絲損傷內

3、膜病理性增生模型，在損傷血管局部過表達miR-34a，研究miR-34a對血管損傷后內膜新生的作用。
　　結果:
　　原代血管平滑肌細胞經(jīng)歷血清饑餓，F(xiàn)BS、PDGF-BB、ox-LDL刺激后表型由“收縮型”向“增殖遷移型”轉化，在此過程中miR-34a表達顯著下降。功能研究中，細胞計數(shù)和BrdU實驗發(fā)現(xiàn)過表達miR-34a抑制FBS、PDGF-BB誘導的平滑肌細胞增殖，劃痕實驗和Transwell實驗則表明過表達miR-3

4、4a減弱平滑肌細胞遷移能力，反之抑制miR-34a表達可增加平滑肌細胞增殖、遷移能力。多個miRNA的生物信息學分析數(shù)據(jù)庫和RNA結構分析軟件預測Notch1是miR-34a的靶基因。平滑肌細胞中過表達miR-34a在mRNA和蛋白水平下調Notch1表達，而抑制miR-34a則Notch1表達升高。分子克隆和熒光素酶報告實驗表明，miR-34a高表達能顯著降低Notch13'UTR調控的熒光素酶活性，而對Notch13'UTR中miR

5、-34a結合位點進行突變后，miR-34a對熒光素酶活性的抑制作用被消除。miR-34a和Notch1過表達質粒共轉染，發(fā)現(xiàn)miR-34a抑制平滑肌細胞增殖、遷移，而同時高表達Notch1可消除miR-34a的作用。成功建立小鼠股動脈導絲損傷內膜增生模型，發(fā)現(xiàn)miR-34a在血管損傷后內膜增生過程中顯著下降，損傷血管局部高表達miR-34a可明顯減輕血管損傷后內膜新生。此外，miR-34a高表達減弱Notch1在血管中表達，減少血管新生

6、內膜中PCNA陽性細胞比例，從體內實驗層面驗證了miR-34a下調Notch1抑制平滑肌細胞增殖。
　　結論:
　　本研究成功揭示了miR-34a在血管平滑肌細胞中的新功能。miR-34a抑制血管平滑肌細胞表型轉化后的增殖及遷移能力。Notch1是miR-34a的功能性靶基因，miR-34a直接結合Notch1 mRNA的3'UTR，下調Notch1表達，并通過調控Notch1影響平滑肌細胞功能。在血管損傷內膜病理性增生過程