溶血磷脂酸受體在血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化和遷移中的作用研究.pdf

1、目的：
　　 血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)表型轉(zhuǎn)化是高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化和血管成型術(shù)后再狹窄等心血管病血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的關(guān)鍵性起始步驟，是該類疾病的共同發(fā)病基礎(chǔ)。而增殖的平滑肌細(xì)胞由血管中層向內(nèi)膜遷移是內(nèi)膜增厚一個(gè)重要機(jī)制。VSMC遷移的結(jié)果可導(dǎo)致內(nèi)膜中VSMC大量積聚和結(jié)締組織形成，進(jìn)而促進(jìn)新生內(nèi)膜形成及動(dòng)脈粥樣硬化。溶血磷脂酸(Lysophosphatidic

2、 acid，LPA)是一種具有多種生物學(xué)作用的磷脂信使，其通過(guò)G蛋白藕聯(lián)受體(G-protein-coupledreceptors，GPCR)介導(dǎo)多種生物學(xué)功能。體外及活體實(shí)驗(yàn)均充分證明不飽和LPA可以誘導(dǎo)VSMC表型轉(zhuǎn)化，刺激VSMC遷移和增殖。但LPA通過(guò)哪個(gè)G蛋白藕聯(lián)受體介導(dǎo)VSMC表型轉(zhuǎn)化和遷移尚不清楚。本研究旨在探討溶磷脂酸受體在LPA誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化和遷移中的作用及相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通路。
　　 方法：
　　

3、 1．根據(jù)文獻(xiàn)建立分化表型VSMC培養(yǎng)體系，以不同濃度水平不飽和LPA(0-101μM)干預(yù)大鼠平滑肌細(xì)胞(rat aortic smooth muscle cells，RASMCs)，鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，興奮劑(乙酰膽堿)刺激引發(fā)的細(xì)胞收縮反應(yīng)并照相。反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reversetranscription-polymerase chain reaction，RT-PCR)法和免疫印跡法(Western blot)分別檢測(cè)分化和去

4、分化RASMCs細(xì)胞表型標(biāo)志SMA-α和Osteopontin(OPN)基因及其蛋白的表達(dá)。
　　 2．RT-PCR法檢測(cè)LPA受體基因在分化及去分化表型RASMCs的表達(dá)。
　　 3．在LPA(1μM)刺激下以LPA受體1，3拮抗劑DGPP8：0，高選擇性LPA受體3激動(dòng)劑OMPT以及百日咳毒素(pertussis toxin，PTX)干預(yù)分化表型RASMCs。RT-PCR法和Western blot法分別檢測(cè)SMA-

5、α和OPN基因及其蛋白的表達(dá)，鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，興奮劑(乙酰膽堿)刺激引發(fā)的細(xì)胞收縮反應(yīng)并照相。Western blot法檢測(cè)p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK)，磷酸化p38MAPK(P-p38 MAPK)，細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)，磷酸化ERK(P-ERK)蛋白水平。

6、>　　 4．貼壁法培養(yǎng)RASMCs，取第3-5代平滑肌細(xì)胞，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用Boyden小室法檢測(cè)細(xì)胞遷移。RASMCs(1x105 cells)放置在Boyden小室上室，下室中含有(0-25μM)LPA，上下室中間放置8μm聚碳酸酯濾膜。細(xì)胞孵育6H后進(jìn)行遷移。鏡下隨機(jī)選取4個(gè)視野(X400)，計(jì)數(shù)遷移到濾膜下層的細(xì)胞。
　　 5．在LPA(10μM)條件下，應(yīng)用不同劑量濃度DGPP8：0(0-50μM)和OMPT(0-50

7、μM)處理RASMC，應(yīng)用Boyden小室法檢測(cè)細(xì)胞遷移。
　　 6．(0-25μM)LPA預(yù)處理RASMCs，Western blot法檢測(cè)p38MAPK，P-P38，ERK，P-ERK蛋白水平。
　　 7．在LPA(10μM)條件下以DGPP8：0(50μM)，預(yù)處理RASMCs，Western blot法檢測(cè)p38 MAPK，P-p38 MAPK，ERK，P-ERK蛋白水平。以p38MAPK抑制劑：SB203580

8、(30μM)，ERK抑制劑：PD98059(30μM)，PTX(100 ng/ml)分別預(yù)處理RASMCs，Boyden小室法檢測(cè)細(xì)胞遷移。Western blot法檢測(cè)p38MAPK，P-p38MAPK，ERK，P-ERK蛋白水平。
　　 結(jié)果：
　　 1．LPA以劑量依賴的方式共同激活p38MAPK和ERK，促使其磷酸化，并誘導(dǎo)RASMCs表型轉(zhuǎn)化。
　　 2．DGPP8：0可阻止LPA誘導(dǎo)的RASMC表型轉(zhuǎn)

9、化，不同劑量OMPT單獨(dú)作用RASMC，對(duì)其表型無(wú)任何影響。當(dāng)DGPP8：0和OMPT共同作用RASMC時(shí)，OMPT在1μM可幾乎完全拮抗DGPP8：0對(duì)RASMC表型轉(zhuǎn)化的阻滯作用。
　　 3．DGPP8：0可阻滯LPA誘導(dǎo)的p38MAPK和ERK磷酸化，OMPT可以誘導(dǎo)ERK磷酸化，但對(duì)于p38MAPK活性沒(méi)有影響。OMPT和DGPP8：0共同作用時(shí)可以消除DGPP8：0對(duì)p38MAPK和ERK磷酸化的拮抗作用。
　　

10、 4．PTX對(duì)于LPA誘導(dǎo)的RASMCs表型轉(zhuǎn)化沒(méi)有影響。
　　 5．LPA以劑量依賴的方式誘導(dǎo)RASMCs遷移。在10μM LPA時(shí)遷移細(xì)胞數(shù)量達(dá)到峰值，隨后下降。
　　 6．DGPP8：0在10μM可顯著抑制RASMCs遷移，在50μM幾乎可完全抑制遷移。小劑量DGPP8：0(0．1-1μM)以及各濃度OMPT(最高至50μM)對(duì)于LPA誘導(dǎo)的遷移幾乎沒(méi)有影響。
　　 7．LPA以劑量依賴的方式刺激p38M

11、APK和ERK磷酸化，在10μM達(dá)到峰值，隨后下降。DGPP8：0(50μM)可以完全阻滯p38MAPK和ERK磷酸化。
　　 8．SB203580(30μM)可以部分但是顯著的抑制遷移；PD98059(30μM)幾乎可完全抑制LPA誘導(dǎo)的ERK磷酸化，但不能阻止LPA誘導(dǎo)的遷移。當(dāng)SB203580和PD98059共同處理RASMCs時(shí)，SB203580對(duì)于RASMCs遷移的抑制作用并未得到加強(qiáng)。
　　 9．PTX可阻止

12、LPA誘導(dǎo)的p38MAPK和ERK磷酸化，幾乎可完全抑制LPA誘導(dǎo)的遷移。
　　 結(jié)論：
　　 1．LPA通過(guò)與Gq蛋白藕聯(lián)的LPA受體3介導(dǎo)了LPA誘導(dǎo)的RASMCs表型轉(zhuǎn)化
　　 2．LPA通過(guò)Gi蛋白藕聯(lián)的LPA受體1，主要經(jīng)由p38MAPK信號(hào)通路介導(dǎo)LPA誘導(dǎo)的RASMCs遷移。
　　 3．阻滯上述通路有可能成為控制與動(dòng)脈粥樣硬化和再狹窄等血管疾病相關(guān)的VSMC表型轉(zhuǎn)化、遷移潛在的治療干預(yù)靶點(diǎn)。