鴨RIG-I在免疫調(diào)節(jié)中的作用及分子調(diào)控機(jī)制.pdf

1、近年來，禽流感特別是高致病性禽流感給養(yǎng)禽業(yè)帶來毀滅性的打擊，并引發(fā)一系列的公共衛(wèi)生安全問題。雞、鴨同為家禽，對(duì)流感病毒有著不同的敏感性，這與宿主本身抗性基因和免疫相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控存在著密切的關(guān)系。維甲酸誘導(dǎo)基因Ⅰ(Retinoic acidinducible geneⅠ，RIG-Ⅰ)能識(shí)別流感病毒并觸發(fā)先天性免疫，該基因在雞基因組上缺失，鴨基因組中保留，這種缺失使得雞與其他禽類相比對(duì)禽流感病毒更易感、臨床癥狀更明顯。但到目前為止，鴨R

2、IG-I是如何發(fā)揮抗病毒作用尚不清楚。
　　本實(shí)驗(yàn)嘗試從不同角度闡釋鴨RIG-Ⅰ在免疫調(diào)節(jié)中的作用及分子調(diào)控機(jī)制，旨在揭示duRIG-Ⅰ在抗病毒先天性免疫信號(hào)傳遞途徑及其代償機(jī)制，并以期進(jìn)一步完善雞體內(nèi)抗病毒先天性免疫途徑及禽類免疫系統(tǒng)相關(guān)的基礎(chǔ)研究。主要研究內(nèi)容如下:
　　1.為探討duRIG-Ⅰ基因的功能，首先克隆獲得了duRIG-Ⅰ eDNA序列，提交GenBank（登錄號(hào)為JQ946323.2和KC869660.1）

3、，發(fā)現(xiàn)了3'UTR存在可變剪接體;間接免疫熒光方法檢測(cè)結(jié)果顯示duRIG-Ⅰ蛋白主要位于細(xì)胞質(zhì)，其次位于細(xì)胞核，進(jìn)一步證實(shí)了該蛋白為胞質(zhì)受體;半定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示duRIG-Ⅰ在心、肝、腎、腺胃、大腸、小腸、肌肉、胸腺和下丘腦等組織的本底表達(dá)均處于較低水平，僅在脾臟和肺臟組織中有少量表達(dá);進(jìn)一步采用poly[I:C]模擬病毒感染，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)感染96 h內(nèi)的脾臟和肝臟中的duRIG-Ⅰ基因的mRNA動(dòng)態(tài)表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)感染

4、8h后脾臟和肝臟中duRIG-Ⅰ基因表達(dá)量均顯著上升（P＜0.05）。
　　2.基于上述duRIG-Ⅰ基因呈誘導(dǎo)性表達(dá)的特點(diǎn)，我們開展了duRIG-Ⅰ表達(dá)調(diào)控研究。首先克隆了duRIG-Ⅰ啟動(dòng)子區(qū)，在線預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)該基因啟動(dòng)子區(qū)存在一個(gè)明顯的CpG島，但BSP進(jìn)一步檢測(cè)結(jié)果顯示，脾臟等中RIG-Ⅰ啟動(dòng)子區(qū)的CpG島處于非甲基化狀態(tài)。雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)duRIG-Ⅰ基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性結(jié)果顯示，在+14～-301 bp存在正調(diào)控，

5、該區(qū)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，IRF1等反式作用因子可能起著重要作用。
　　3.為了證實(shí)duRIG-Ⅰ的激活機(jī)制，對(duì)duRIG-Ⅰ進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)duRIG-Ⅰ基因具有RLRs家族的典型特征（包括CARD結(jié)構(gòu)域、RNA解旋酶等功能結(jié)構(gòu)域），據(jù)此構(gòu)建了不同結(jié)構(gòu)域缺失突變體的表達(dá)載體，經(jīng)RT-PCR、間接免疫熒光和Western blot方法鑒定重組質(zhì)粒的表達(dá)，利用RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)CARD結(jié)構(gòu)域能介導(dǎo)RLR通路

6、上IFN-β、Mxl及PKR基因的表達(dá)顯著上調(diào);進(jìn)一步采用NF-κB熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)和ELISA檢測(cè)poly[I:C]介導(dǎo)的IFN-β的表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)poly[I:C]誘導(dǎo)，duRIG-Ⅰ被顯著激活，同時(shí)CARDs結(jié)構(gòu)域能夠通過激活NF-κB促使IFN-β的產(chǎn)生。
　　4.為進(jìn)一步探索duRIG-Ⅰ基因在抗病毒先天性免疫中的作用，慢病毒介導(dǎo)的duRIG-Ⅰ基因在DF-1細(xì)胞中持續(xù)穩(wěn)定高表達(dá)，獲得了穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株DF-1/LV5-R

7、IG-Ⅰ和DF-I/LV5，并用RT-PCR及Western Blot驗(yàn)證duRIG-Ⅰ基因mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)情況，為下一步研究提供了細(xì)胞模型。
　　5.為探索duRIG-I在抗病毒先天性免疫信號(hào)傳遞途徑及其代償機(jī)制，我們利用5'ppp-dsRNA模擬病毒感染，進(jìn)行RNA-seq，共篩選出278個(gè)差異基因（duRIG-Ⅰ基因介導(dǎo)的應(yīng)答基因），其中120個(gè)差異基因被注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫中，富集分析最可靠的通路為RIG-Ⅰ樣

8、受體信號(hào)通路;GO二級(jí)功能的富集分析主要富集在Ⅰ型干擾素信號(hào)通路、T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性正向調(diào)控、β干擾素的細(xì)胞應(yīng)答、RIG-Ⅰ信號(hào)通路的正向調(diào)控等條目;通過Cytoscape軟件，基于通路上共有的差異基因，構(gòu)建了RIG-Ⅰ信號(hào)通路與其他信號(hào)通路交聯(lián)的關(guān)系網(wǎng)路圖，推測(cè)Jak-STAT信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體關(guān)聯(lián)、Wnt信號(hào)通路、泛素介導(dǎo)的蛋白水解作用、MAPK信號(hào)通路等在抗病毒信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中可能與RIG-Ⅰ