調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在poly I-C-D-GalN誘發(fā)的肝臟損傷中的免疫調(diào)節(jié)作用.pdf

1、目的：我們前期的研究發(fā)現(xiàn)病毒模擬物polyI:C和致敏劑D-GalN聯(lián)合注射可以誘發(fā)急性肝損傷,該損傷主要是由天然免疫細(xì)胞介導(dǎo),其中Kupffer細(xì)胞和NK細(xì)胞起到重要作用。而且我們發(fā)現(xiàn)該損傷可以自愈。而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞具有顯著的免疫抑制作用,并且被證實(shí)在ConA誘導(dǎo)的急性肝炎中對(duì)限制肝臟損傷起了重要作用。所以我們推測(cè)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞同樣可以限制polyI:C/D-GalN誘導(dǎo)的肝臟損傷。Rag1-/-小鼠(lymphocyte-deficie

2、ntrecombinaseactivatinggene-1-null)是淋巴細(xì)胞缺陷鼠,沒有T、B細(xì)胞,是目前國(guó)際上研究調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能的常用小鼠。本文主要觀察比較野生型C57BL/6小鼠、以及抗體清除調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的C57BL/6小鼠以及過繼轉(zhuǎn)輸調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的Rag1-/-小鼠在polyI:C/D-GalN聯(lián)合注射后誘發(fā)的爆發(fā)性肝炎模型中的肝臟損傷程度輕重以及相關(guān)炎性因子的動(dòng)態(tài)變化,探討調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在polyI:C/D-GalN誘發(fā)的急

3、性肝臟損傷中的免疫調(diào)節(jié)作用。
　　方法：建立polyI:C/D-GalN誘發(fā)的爆發(fā)性肝炎小鼠模型,于感染后12,18,24,和48小時(shí)剖殺小鼠,測(cè)定野生型C57BL/6小鼠和Rag1-/-小鼠在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)血清ALT活性;肝臟石蠟切片,HE染色后觀察比較野生型C57BL/6小鼠和Rag1-/-小鼠在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)肝臟炎癥反應(yīng)的輕重;用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)方法,檢測(cè)比較野生型C57BL/6小鼠和Rag1-/-小鼠在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)

4、肝臟TNF-α和IFN-γmRNA水平;ELISA法檢測(cè)比較野生型C57BL/6小鼠和Rag1-/-小鼠在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)血清IFN-γ和TNF-α蛋白水平;進(jìn)一步用抗-CD25抗體(mAb,clonePC61.5.3)清除調(diào)節(jié)性T細(xì)胞,清除鼠和野生型小鼠用polyI:C/D-GalN聯(lián)合注射后,觀察比較野生型小鼠和清除鼠肝臟的炎癥損傷程度以及各個(gè)時(shí)間點(diǎn)肝臟TNF-α和IFN-γmRNA水平以及血清IFN-γ和TNF-α蛋白水平的區(qū)別;然后給

5、Rag1-/-小鼠轉(zhuǎn)輸調(diào)節(jié)性T細(xì)胞之后polyI:C/D-GalN注射,檢測(cè)血清ALT活性以及肝臟病理切片觀察肝臟炎癥損傷;結(jié)果polyI:C/D-GalN聯(lián)合注射后,與野生型小鼠相比,Rag1-/-小鼠血清ALT活性在18和24小時(shí)明顯增高(P<0.01),而在12和48小時(shí)兩者沒有明顯區(qū)別(P>0.05)。肝臟HE染色結(jié)果顯示,與野生型小鼠相比Rag1-/-小鼠在18和24小時(shí)有更嚴(yán)重的肝臟充血,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和肝細(xì)胞壞死,而在注射后

6、12小時(shí)兩者肝臟損傷無明顯差別,到了注射后48小時(shí)野生型小鼠肝臟損傷基本愈合,Rag1-/-小鼠肝臟仍有輕微充血。Rag1-/-小鼠肝臟炎性因子IFN-γmRNA表達(dá)在12,18,24和48小時(shí)顯著增強(qiáng),明顯高于WT小鼠(P<0.05)。而TNF-αmRNA水平兩者無明顯差別(P>0.05)。Rag1-/-小鼠血清IFN-γ和TNF-α蛋白水平在18,24和48小時(shí)顯著增強(qiáng),明顯高于野生型小鼠(P<0.05),12小時(shí)兩者無明顯差別(P

7、>0.05)。用抗-CD25抗體清除小鼠調(diào)節(jié)性T之后,FCM檢測(cè)小鼠肝臟調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例由18.62％下降為7.73%。清除鼠和野生型小鼠在polyI:C/D-GalN聯(lián)合注射后,與野生型小鼠相比,清除鼠肝臟HE染色結(jié)果顯示,18和24小時(shí)有更嚴(yán)重的肝臟充血,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和肝細(xì)胞壞死,到了注射后48小時(shí)野生型小鼠肝臟損傷基本愈合而清除鼠肝臟仍可見充血。清除鼠血清ALT活性在18和24小時(shí)明顯高于野生型小鼠(P<0.01),在12和48

8、小時(shí)兩者血清ALT的水平未見明顯差別(P>0.05)。清除鼠肝臟炎性因子IFN-γ和TNF-αmRNA表達(dá)在18,24和48小時(shí)顯著增強(qiáng),明顯高于野生型小鼠(P<0.05),血清IFN-γ和TNF-α蛋白水平在18,24和48小時(shí)顯著增強(qiáng),明顯高于WT小鼠(P<0.05)。同樣在注射后12小時(shí)清除鼠和野生型小鼠炎性因子IFN-γ和TNF-αmRNA水平和蛋白水平均無明顯差別(P>0.05)。跟過繼轉(zhuǎn)輸CD25-細(xì)胞以及未轉(zhuǎn)輸細(xì)胞的Rag

9、1-/-小鼠相比,過繼轉(zhuǎn)輸調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的Rag1-/-小鼠在polyI:C/D-GalN注射后血清ALT活性明顯降低(P<0.05),肝臟HE染色結(jié)果也顯示肝臟充血和肝細(xì)胞壞死明顯減輕。
　　結(jié)論：在polyI:C/D-GalN誘發(fā)的爆發(fā)性肝炎模型中,與野生型小鼠相比,缺失調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的Rag1-/-小鼠肝臟炎癥損傷更重,炎性因子的表達(dá)升高。清除調(diào)節(jié)性T細(xì)胞之后,與野生型小鼠相比清除鼠的肝臟炎癥損傷也加重,炎性因子的表達(dá)同樣升高。