CpG-ODN-Poly(I-C)核酸緩釋佐劑對(duì)REV亞單位-DNA疫苗反應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)作用.pdf

1、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒是一種可引起感染雞只產(chǎn)生免疫抑制和網(wǎng)狀細(xì)胞瘤的RNA病毒，感染REV后的雞只由于疫苗免疫后抗體反應(yīng)受到顯著抑制從而易于感染其它疾病，這給養(yǎng)雞業(yè)可能帶來不可估量的損失。近年來，REV感染率有明顯上升的趨勢，利用亞單位疫苗或DNA疫苗防制該病被認(rèn)為是最具潛力的措施，但提高亞單位疫苗和DNA疫苗免疫保護(hù)反應(yīng)也是亟待解決的科學(xué)技術(shù)問題，本課題利用CpG ODN/Poly(I:C)制備成新型核酸緩釋佐劑，分別與REV亞單位

2、疫苗抗原/DNA疫苗抗原聯(lián)合免疫接種雛雞，探討了它們對(duì)兩種疫苗免疫保護(hù)反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用。
　　本研究首先從REV病毒感染細(xì)胞中擴(kuò)增獲得囊膜蛋白gp90基因，分別構(gòu)建了重組原核表達(dá)載體pET-32a-gp90和DNA真核表達(dá)載體PVAX1-gp90。構(gòu)建的pET-32a-gp90表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至Rosseta(DE3)菌體內(nèi)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)獲得高表達(dá)的重組蛋白產(chǎn)物，利用SDS-PAGE和REV單抗介導(dǎo)的Western blot進(jìn)行目的蛋

3、白的鑒定分析，經(jīng)鎳柱純化和蛋白定量后用作接種抗原。構(gòu)建的DNA真核表達(dá)載體PVAX1-gp90用脂質(zhì)體Lipo3000瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）和哺乳動(dòng)物細(xì)胞（BHK-21），用REV單抗介導(dǎo)的IFA分析其在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，定量后用作DNA接種抗原。將CpG ODN與Poly(I:C)制備成核酸緩釋佐劑，分別與上述制備的亞單位疫苗抗原和DNA疫苗抗原聯(lián)合免疫雛雞，加強(qiáng)免疫兩次，使用美國IDEXX公司的REV抗體檢測試劑盒動(dòng)態(tài)監(jiān)測雛雞

4、血清抗體，并結(jié)合攻毒試驗(yàn)分析對(duì)接種雞只的免疫保護(hù)效果。此外，利用病毒中和試驗(yàn)分析誘導(dǎo)的抗血清對(duì)REV病毒特異性中和作用。
　　結(jié)果表明，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到大小為918 bp的目的基因，原核表達(dá)后獲得大小為51Kd的重組蛋白，該蛋白能夠與REV單抗發(fā)生特異性免疫反應(yīng)；所構(gòu)建的DNA真核重組表達(dá)載體PVAX1-gp90能夠分別在BHK-21和CEF細(xì)胞中表達(dá)，以上結(jié)果顯示抗原制備成功。用制備的核酸緩釋佐劑分別聯(lián)合接種雛雞后顯示（1）Cp

5、G佐劑與gp90重組蛋白接種雛雞后可以誘導(dǎo)雛雞產(chǎn)生顯著增高的REV血清抗體，抗體陽性率可達(dá)到100％；而Poly(I:C)佐劑雖沒有顯著提高雞只的血清抗體滴度和雞只抗體陽性率，但兩種核酸緩釋佐劑卻都能顯著增強(qiáng)亞單位疫苗抗原的抗病毒作用，顯著降低 REV攻毒所造成的致病作用（包括病毒血癥百分率和疫苗反應(yīng)抑制）。（2）CpG緩釋佐劑和CpG+Poly(I:C)緩釋佐劑均能增強(qiáng)DNA真核質(zhì)粒PVAX1-gp90的抗體滴度和抗體陽性率，均能夠顯

6、著降低REV攻毒導(dǎo)致的病毒血癥。（3）體外病毒中和試驗(yàn)結(jié)果表明，利用疫苗接種獲得的不同滴度的血清抗體能夠中和一定劑量的病毒，這種中和作用與血清抗體稀釋度和病毒劑量高低呈相關(guān)性；IFA結(jié)果顯示雞血清抗體免疫球蛋白Ig能夠直接結(jié)合CEF中的病毒粒子。
　　結(jié)論：CpG-ODN緩釋佐劑可以顯著增強(qiáng)REV基因工程亞單位疫苗抗原的抗體反應(yīng)，并對(duì)接種雞只起到完全的保護(hù)作用。Poly(I:C)緩釋佐劑雖不能顯著增加REV亞單位疫苗的抗體反應(yīng)，但