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文檔簡介
1、人免疫缺陷病毒Ⅰ型(Human Immunodeficiency Virus TypeⅠ,HIV—1)感染可以導(dǎo)致獲得性免疫缺陷綜合癥(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS),即艾滋病。艾滋病已成為有史以來最具破壞性的傳染病之一:目前全球共存活艾滋病病毒感染者和病人(HIV/AIDS)約3340萬人。在我國艾滋病的流行狀況也非常嚴峻:2009年當(dāng)年中國新發(fā)艾滋病病毒感染者就有4.8萬人,病情發(fā)展
2、的速度已是全球最快的國家之一。流行病學(xué)調(diào)查顯示我國HIV—1最主要的流行亞型或流行重組型是CRF07_BC,CRF08_BC,B’(泰國B)和CRF01_AE。其中AE重組型病毒主要通過性接觸途徑傳播,感染比例每年在大幅度上升,約占總流行率的50%。以往的研究提示:T細胞疫苗所活化的免疫反應(yīng)廣度對疫苗效果具有重要影響。為了提高HIV—1候選DNA疫苗所活化的T細胞反應(yīng)廣度,本實驗室在以往的研究中設(shè)計、構(gòu)建了表達HIV—1 AE2f ta
3、t—rev—intergrase(c—half)—vif—nef融合基因(TRIVN)的DNA疫苗。然而,在小鼠免疫實驗中我們發(fā)現(xiàn)TRIVN融合基因疫苗的免疫原性并不理想,其所活化的特異性T細胞反應(yīng)強度遠遠低于HIV—1 Env等結(jié)構(gòu)蛋白。為了提高TRIVN融合基因DNA疫苗的免疫原性,本研究以霍亂腸毒素(Cholera toxin,CT)、A亞單位(CTA)及B亞單位(CTB)為佐劑,通過CTA/CTB蛋白與TRIVN融合基因DNA疫
4、苗混合免疫和構(gòu)建CTA/CTB—TRIVN融合DNA疫苗兩種方式探討上述兩種佐劑對TRIVN免疫原性的改善作用。
本研究共分三步進行:第一步,CTA和CTB的表達純化?;魜y腸毒素是引起霍亂的主要致病因子,由一個A亞單位(CTA)和5個相同的B亞單位(CTB)組成,是一種很強的免疫原和粘膜免疫佐劑。但是,天然分離純化的CTA和CTB蛋白由于分離的技術(shù)問題導(dǎo)致純化出的蛋白會因彼此相互摻雜而影響最后對蛋白功能的判定,因而天然純化
5、的蛋白難以有效地研究其佐劑特性的具體機制。國內(nèi)多項研究顯示,CTA/CTB在大腸桿菌中的表達一直比較困難,而目前能表達出的是pET—32a基礎(chǔ)上的額外增加20KDa的TRx標(biāo)簽的蛋白,對于蛋白功能的研究存在一定的影響。為此,我們摸索了CTA和CTB的表達純化條件,通過氯霉素的加入,成功構(gòu)建了pET—30a—CTA及pET—30a—CTB原核表達載體,并誘導(dǎo)表達出了具有活性的19KD的CTB和30 KD的CTA蛋白。
第二步
6、,通過兩種方式觀察佐劑效應(yīng),第一種是CTA/CTB蛋白與TRIVN融合基因DNA疫苗混合免疫。為了評價上述表達純化的CTA和CTB與DNA疫苗混合后活化的免疫反應(yīng)特征,我們用已構(gòu)建好的TRIVN DNA疫苗配伍CTA、CTB或CT,肌肉注射免疫小鼠4次,最后一次免疫兩周后處死小鼠進行檢測?;贗FN—γ檢測的ELISPOT實驗顯示,就總T細胞反應(yīng)強度來看,對照AE—TRIVN(520±120
SFCs/106splenoc
7、ytes)均低于AE—TRWN+CT組(658±170 SFCs/106 splenocytes),AE—TRIVN+CTA組(692+220 SFCs/106 splenocytes),AE—TRIVN+CTB組(734±270SFCs/106 splenocytes)。此外,雖然組間比較沒能達到統(tǒng)計學(xué)意義上的顯著性,但AE—TRIVN所激發(fā)的總T細胞反應(yīng)強度在混合入CT或者CTA或者CTB之后,免疫反應(yīng)都在一定程度上得到提高。說明C
8、T及其亞單位與TRIVN疫苗簡單混合的方式免疫,免疫原性的改善不夠顯著,在配伍的形式上還需進一步優(yōu)化。
接下來,我們進一步考慮第二種方式:構(gòu)建CTA/CTB—TRIVN融合基因疫苗并觀察其免疫原性??紤]到常規(guī)的方法如:酶切連接進而在載體上不斷插入新的序列,這樣的方法由于在共表達蛋白之間添加了多余的堿基而有可能發(fā)生誤讀,且費時費力,效率也不高。為了能夠準(zhǔn)確無誤地表達以上融合蛋白,我們首次利用overlap pcr方法,將TR
9、IVN基因和人源化的CTA或CTB基因進行融合,經(jīng)基因測序證實成功構(gòu)建了pSV1.0—TRIVN—CTA和pSV1.0—TRIVN—CTB。免疫結(jié)果顯示:從總T細胞反應(yīng)強度來看,AE—TRIVN—CTB活化的T細胞免疫反應(yīng)為1548±330 SFCs/106脾細胞,顯著高于AE—TRIVN活化的710.25±310 SFCs/106脾細胞(p<0.05),并且AE—TRIVN—CTA所活化的T細胞免疫反應(yīng)為1642±514 SFCs/1
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