斑點(diǎn)叉尾鯝IL-1β基因克隆表達(dá)及作為亞單位疫苗佐劑的免疫效果研究.pdf

1、細(xì)胞因子是由機(jī)體相關(guān)免疫細(xì)胞產(chǎn)生的，具有生物調(diào)節(jié)和多種生物學(xué)功能的活性物質(zhì)。近幾十年，國內(nèi)外學(xué)者熱衷于魚類細(xì)胞因子重組蛋白作為疫苗佐劑研究，結(jié)果顯示許多種重組細(xì)胞因子蛋白如干擾素(IFN)、腫瘤壞死因子(TNF)、粒細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)等，都能不同程度的增加滅活苗、弱毒菌、亞單位疫苗等常規(guī)疫苗的免疫效應(yīng)。它在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答反應(yīng)過程中起重要作用，被公認(rèn)為新型疫苗的較好免疫佐劑。本研究以斑點(diǎn)叉尾鮰白

2、細(xì)胞介素-1β（IL-1β）基因?yàn)檠芯繉?duì)象，成功克隆并表達(dá)了IL-1基因重組蛋白;研究了其作為亞單位疫苗佐劑對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰的免疫保護(hù)效果。
　　1、斑點(diǎn)叉尾鮰IL-1β基因克隆及原核表達(dá)
　　根據(jù)GenBank中公布的斑點(diǎn)叉尾鮰IL-1β1和IL-1β2基因序列（GenBank登錄號(hào)分別為:DQ160229、DQ160230），運(yùn)用生物學(xué)軟件設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得的目的片段IL-邛1和IL-1β2分別克隆至pMD1

3、9-T載體;經(jīng)鑒定正確后用BamHⅠ和XhoⅠ將目的片段從克隆質(zhì)粒上切出，連接到表達(dá)載體pET-32a(+)，獲得重組質(zhì)粒pET-32a(+)-IL-1β1/β2。然后，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21(DE3)，進(jìn)而對(duì)重組BL21(DE3)細(xì)菌進(jìn)行誘導(dǎo)溫度、時(shí)間和IPTG濃度優(yōu)化;最后在最優(yōu)條件下大量誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，將純化的重組蛋白-80℃保存?zhèn)溆?western-blot檢測(cè)抗體與重組蛋白特異性。結(jié)果顯示:表達(dá)的重組蛋白IL-1β1和IL-

4、1β2均約為48.1Kda，表達(dá)的最佳條件為37℃，IPTG濃度0.5mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間為4h; western-blot分析結(jié)果表明重組蛋白具有較好的特異性。
　　2、重組斑點(diǎn)叉尾鮰IL-1β作為亞單位疫苗佐劑的免疫效果研究將克隆表達(dá)出來的重組蛋白IL-1β1和IL-1β2分別與亞單位疫苗pSCPI等體積混合，通過腹腔注射免疫斑點(diǎn)叉尾鮰，分別于免疫后的第1、2、3、4、5、6、7和8周進(jìn)行尾靜脈采血，測(cè)定其血清抗體效價(jià)、血清

5、殺菌活性、ACH50活性和溶菌酶活性;另外，在免疫第4周進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，記錄統(tǒng)計(jì)死亡率和免疫保護(hù)率。結(jié)果顯示，重組白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)作為亞單位疫苗佐劑能夠提高斑點(diǎn)叉尾鮰的血清殺菌活性、ACH50活性和溶菌酶活性;同時(shí)，血清殺菌活性結(jié)果表明血清中起主要?dú)⒕饔玫某煞质茄a(bǔ)體和抗體;佐劑疫苗組和無佐劑疫苗組抗體水平均在第4周達(dá)到峰值，其中IL-1β1+IL-1β2對(duì)提高亞單位疫苗pSCPI的抗體水平效果最明顯，而IL-1β1和IL-

6、1β2對(duì)亞單位疫苗pSCPI的影響基本上相同;攻毒后PBS、pSCPI、pSCPI+IL-1β1、pSCPI+ IL-1β2和pSCPI+ IL-1β1+ IL-1β2組累計(jì)死亡率分別為:93.33％、46.67％、36.67％、33.33％和23.33％。pSCPI、pSCPI+ IL-1β1、pSCPI+ IL-1β2和pSCPI+ IL-1β1+ IL-1β2組相對(duì)保護(hù)率分別為:50.1％、61.71％、65.29％和75.01％