魚源無乳鏈球菌bca基因的克隆、表達及亞單位疫苗和核酸疫苗的研究.pdf

1、無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）是常見的人獸魚共患病原菌，自2007年以來，該菌每年都在我國廣東、海南、福建、廣西等羅非魚主要養(yǎng)殖區(qū)暴發(fā)流行，造成巨大經(jīng)濟損失，嚴重威脅著我國羅非魚產(chǎn)業(yè)鏈的健康發(fā)展。到目前為止，對羅非魚無乳鏈球菌病的治療效果欠佳，且未有可大面積推廣的有效疫苗。本研究以無乳鏈球菌C抗原α蛋白(編碼基因bca)為研究對象，通過對α蛋白的生物信息學(xué)分析，以bca基因N端保守區(qū)，分別構(gòu)建了亞單位疫苗

2、和核酸疫苗，并用構(gòu)建的疫苗免疫羅非魚，評估了疫苗的免疫效果。主要研究內(nèi)容如下:
　　1.魚源無乳鏈球菌bca基因的克隆表達以及生物信息學(xué)分析
　　克隆了羅非魚源無乳鏈球菌HN0101分離株的bca基因，通過生物信息學(xué)軟件對其序列進行了分析，結(jié)果顯示:bca基因的ORF由1341個堿基組成，編碼一個長度為446個氨基酸的多肽，N-端具有一個保守的YSIRK信號肽序列和一個AlphaC_N超家族結(jié)構(gòu)域，C-末端含有1個保守Gra

3、m_pos_anchor超家族結(jié)構(gòu)域，而在中間具有2個重復(fù)的Rib結(jié)構(gòu)域;比較不同來源分離株的α蛋白結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)主要區(qū)別在于Rib結(jié)構(gòu)域重復(fù)數(shù)目的不同;同源性及系統(tǒng)進化樹分析，發(fā)現(xiàn)本株菌的α蛋白與已報道的人源A909和魚源GD201008-001α蛋白聚為一簇，同源性達100％;推測該蛋白為親水性蛋白，存在一個跨膜區(qū)，有37個潛在的磷酸化位點和1個潛在的N-糖基化位點;二級結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)存在較多的無規(guī)則卷曲，推測有12個氨基酸區(qū)域可能是B細

4、胞抗原表位;當選擇大腸桿菌BL21為表達宿主時，該重組蛋白的溶解度高達100％，亞細胞定位顯示該蛋白位于細胞壁上。
　　2.無乳鏈球菌pbca基因重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建及免疫原性分析
　　根據(jù)對bca基因生物信息學(xué)分析結(jié)果，去掉跨膜區(qū)和革蘭氏陽性菌錨定區(qū)域，選取表達部位51-401AA區(qū)間設(shè)計特異性引物進行PCR擴增，擴增片段經(jīng)膠回收后克隆至pMD19-T載體，鑒定正確后用BamHⅠ和XhoⅠ將目的片段從克隆質(zhì)粒上切出，并連接至

5、表達載體pET-32a(+)，得到重組表達質(zhì)粒pET-32a(+)-pbca;將重組表達質(zhì)粒經(jīng)鑒定正確后轉(zhuǎn)入BL21(DE3)，然后對重組表達宿主菌的誘導(dǎo)溫度、IPTG濃度和誘導(dǎo)時間進行優(yōu)化;在最優(yōu)條件下大量誘導(dǎo)表達重組蛋白，然后以純化的重組蛋白制備兔抗高免血清，用瓊擴試驗檢測抗體效價，并運用western-blot檢測抗體與重組蛋白的免疫原性。結(jié)果顯示:最佳表達條件為溫度37℃，IPTG濃度為0.1mmol/L，誘導(dǎo)時間為4h;瓊脂糖

6、擴散試驗顯示制備的兔抗pBCA血清的抗體效價為1∶32;western-blot分析結(jié)果表明制備的血清能夠與重組蛋白進行特異性結(jié)合。
　　3.無乳鏈球菌pbca基因重組亞單位疫苗對羅非魚免疫效果的研究
　　將制備的重組pBCA，分別以pBCA組、pBCA佐劑組和PBS對照組腹腔注射免疫健康羅非魚，分別在免疫后第7d、14d、21d、28d、35d、42d采集血清，用建立的ELISA方法檢測免疫抗體，結(jié)果顯示pBCA組和pBC

7、A佐劑組均能誘導(dǎo)魚體產(chǎn)生抗體，并且pBCA組在第四周抗體水平達到最高，pBCA佐劑組在第五周抗體水平達到最高。pBCA組和pBCA佐劑組與PBS對照組在第二周開始，抗體水平差異極顯著(P＜0.01);溶菌酶活性分析發(fā)現(xiàn)，從免疫后第一周到第六周，pBCA組和pBCA佐劑組溶菌酶活力均極顯著高于PBS對照組(p＜0.01)，并且從第二周到第六周，pBCA組和pBCA佐劑組溶菌酶活力均維持較高水平，pBCA組在第四周達到最高峰，pBCA佐劑組

8、在第五周得到最高峰;對羅非魚的IL-1β和TNF-a基因在組織中轉(zhuǎn)錄分析發(fā)現(xiàn)，IL-1β和TNF-α基因在免疫組中，在脾臟和頭腎都有極顯著的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，且在脾臟中的轉(zhuǎn)錄水平高于在頭腎中的轉(zhuǎn)錄水平。攻毒試驗結(jié)果顯示，pBCA佐劑組和pBCA組的相對保護率分別為66.67％和52.38％。以上結(jié)果表明重組pBCA具有較好的免疫保護作用，可以作為候選疫苗之一。
　　4.無乳鏈球菌pbca基因核酸疫苗的構(gòu)建
　　將pbca基因克隆

9、至真核表達載體pcDNA3.1(+)構(gòu)建了重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-pbca，然后通過菌落PCR以及雙酶切進行pbca基因的鑒定。鑒定正確后，將構(gòu)建的真核重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-pbca的陽性克隆分別接種于2L LB液體培養(yǎng)基中，擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒。提取的重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-pbca經(jīng)電泳檢測，條帶大小約7200bp，與預(yù)計的大小一致，經(jīng)分析pcDNA3.1(+)-pbca濃度為1.4mg/L，0D268/28

10、0＞1.8，質(zhì)粒純度較高可以作為核酸疫苗使用。
　　5.無乳鏈球菌pbca基因核酸疫苗對羅非魚免疫效果的研究
　　將制備好的重組質(zhì)粒以肌肉注射的方式免疫羅非魚，分為DNA重組質(zhì)粒組、空質(zhì)粒組和PBS對照組，免疫后第7d、14d、21d采集肌肉組織，提取總RNA，RT-PCR擴增以確定疫苗注射后目的基因表達情況。結(jié)果表明DNA重組質(zhì)粒疫苗組的三個時間點樣品均擴增出目的基因，而空質(zhì)粒組和PBS對照組未擴增出目的基因，證明重組表達

11、質(zhì)粒在魚體內(nèi)得到成功轉(zhuǎn)錄，構(gòu)建的核酸疫苗獲得成功。分別在免疫后第7d、14d、21d、28d、35d、42d采集血清，用建立的ELISA方法檢測免疫抗體，結(jié)果顯示重組質(zhì)粒能誘導(dǎo)魚體產(chǎn)生特異性抗體，到第四周時，抗體水平達到最高峰，第五周和第六周都維持較高水平。溶菌酶活性分析發(fā)現(xiàn)，從免疫后第一周到第六周，DNA疫苗組溶菌酶活力均極顯著高于PBS對照組(p＜0.01)，并且從第三周到第六周，DNA疫苗組溶菌酶活力均維持較高水平，在第五周達到最