豬鏈球菌2型谷氨酸脫氫酶的克隆表達、單抗制備及核酸疫苗的初步研究.pdf

1、豬鏈球菌(Streptococcus suis，S.suis)是一種重要的人畜共患病病原體，能夠引致豬和人的腦膜炎、敗血病、胸膜炎、關(guān)節(jié)炎、永久性耳聾及突發(fā)性死亡，給人民的生命和財產(chǎn)構(gòu)成極大威脅。 豬鏈球菌的種類繁多，毒力因子非常復(fù)雜，主要有莢膜多糖、溶菌酶釋放蛋白、胞外因子、溶血素等。相繼有學(xué)者報道新發(fā)現(xiàn)的毒力相關(guān)因子，谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase,GDH)即為其中之一。但是國際上對這些毒力相

2、關(guān)因子還存在爭論。目前國內(nèi)僅對豬鏈球菌2型的毒力因子MRP、EF及溶血素有一些相關(guān)報道，對于近年來不斷出現(xiàn)的新的毒力相關(guān)因子還缺乏相應(yīng)的研究。谷氨酸脫氫酶是連接碳代謝和氮代謝的一個關(guān)鍵酶，是細菌能量代謝過程中十分重要的功能分子，對其致病性有重要意義；它同時還是一種進化上極為保守的蛋白，是病原體種屬鑒定時重要的診斷性抗原。 本實驗克隆表達豬鏈球菌2型GDH，并對其酶活性進行研究，且探討了GDH在豬鏈球菌檢測方法的建立及疫苗研制中

3、的應(yīng)用價值。 1.豬鏈球菌2型谷氨酸脫氫酶編碼基因克隆、序列分析及原核表達 根據(jù)已發(fā)表的豬鏈球菌2型的gdh基因設(shè)計引物，擴增海安病人分離株Habb中的目的基因，并進行序列測定和分析；構(gòu)建重組表達載體pGEX4T-2-gdh，在大腸桿菌中表達，并純化重組蛋白。結(jié)果克隆到的豬鏈球菌gdh編碼基因經(jīng)測序含1347bp；序列分析表明豬鏈球菌GDH屬于GDH蛋白家族工；表達產(chǎn)物為帶有GST標簽的融合蛋白，分子量為71kDa；用凝

4、血酶切掉GST標簽后的產(chǎn)物分子量為45kDa。 2．基因工程豬鏈球菌2型GDH酶活性測定及其免疫原性研究 檢測表達的豬鏈球菌谷氨酸脫氫酶的酶活性，利用PCR方法檢測gdh基因在豬鏈球菌不同血清型中的存在情況，利用重組蛋白制備多克隆抗體，運用Western blot方法分析其與豬鏈球菌不同血清型的免疫反應(yīng)情況。GDH活性測定顯示豬鏈球菌GDH是NADP(H)-特異性GDH，利用α-酮戊二酸做底物，用NADPH做輔酶催化氨的

5、同化和谷氨酸的合成。gdh基因在豬鏈球菌大部分血清型中保守存在，重組表達的蛋白具有免疫原性。 3豬鏈球菌2型GDH單克隆抗體的研制 以豬鏈球菌全菌以及基因工程GDH為抗原，分別免疫BALB／c小鼠，將免疫的小鼠脾細胞與小鼠SP2／0骨髓瘤細胞進行融合，經(jīng)ELISA方法篩選陽性克隆，再用有限稀釋的方法進行克隆化培養(yǎng)，最后共獲得四株能穩(wěn)定分泌抗GDH單克隆抗體(McAbs)的雜交瘤細胞株。 4信號肽與豬鏈球菌2型G