擬穴青蟹谷氨酸脫氫酶基因的全長cDNA克隆及低滲下的表達分析.pdf

1、擬穴青蟹(Scylla paramamosain)是我國東南沿海主要的海水養(yǎng)殖蟹類之一，具有重要的經(jīng)濟價值與食用價值。但隨著環(huán)境條件的日益惡化和集約化養(yǎng)殖的發(fā)展，由養(yǎng)殖水體環(huán)境低滲脅迫引起擬穴青蟹滲透失衡而導(dǎo)致養(yǎng)殖擬穴青蟹疾病頻發(fā)。谷氨酸脫氫酶（Glutamate dehydrogenase，GDH）是調(diào)節(jié)脯氨酸、甘氨酸和丙氨酸代謝的關(guān)鍵酶之一。此三種游離氨基酸是常見的滲透效應(yīng)物，在甲殼動物滲透調(diào)節(jié)中起重要作用。而有關(guān)GDH基因在甲殼動

2、物中的研究并不多見。本實驗采用同源克隆策略和RACE技術(shù)在擬穴青蟹鰓上成功克隆得到GDH基因的全長cDNA序列，并分析GDH基因核苷酸序列、氨基酸序列結(jié)構(gòu)及其在擬穴青蟹不同組織中的表達情況。同時研究擬穴青蟹在不同低滲處理下其肌肉中GDH基因表達量與游離氨基酸的變化情況，探究GDH基因與甲殼動物滲透調(diào)節(jié)的關(guān)系及其調(diào)控機制。
　　擬穴青蟹GDH基因全長為2269 bp，包括1662 bp的ORF，編碼由533個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，5'

3、 UTR（5'端非編碼區(qū)）為37 bp，3'UTR（3'端非編碼區(qū)）為570 bp，GenBank的登錄號為KM189809。生物信息學(xué)分析表明擬穴青蟹GDH基因具有一段由17個氨基酸殘基構(gòu)成的信號肽序列。與其他物種GDH基因氨基酸序列進行同源性分析比較，結(jié)果顯示擬穴青蟹GDH基因與中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）GDH基因同源性最高(93％)，其后依次為凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)GDHb基

4、因(92％)，中華對蝦（Fenneropenaeus chinensis）GDH基因(91％)，凡納濱對蝦GDHa基因(89％)。聚類分析表明，擬穴青蟹GDH基因氨基酸序列與中華絨螯蟹密聚為一支，又與凡納濱對蝦及中國對蝦組成的一支聚成一個小支。
　　經(jīng)實時熒光定量PCR檢測，擬穴青蟹GDH基因在血細胞、肌肉、腸、觸角腺、肝胰腺、心臟和鰓這7個組織中均有表達，且表達量不同。其中GDH基因在擬穴青蟹的肌肉中表達量最高，其次為肝胰腺與鰓

5、，在血細胞中表達量最低。
　　環(huán)境鹽度從28驟降至5的實驗結(jié)果表明，血淋巴滲透壓在6h急劇下降至最低值;GDH基因表達量急劇下降，同樣在6h到達最低值為初始值的29.6％;肌肉中總游離氨基酸含量顯著下降，其中包括谷氨酸、甘氨酸和谷氨酰胺的含量，而絲氨酸含量顯著上升。血淋巴中總游離氨基酸含量顯著升高，與GDH基因表達結(jié)果呈相反趨勢，對環(huán)境低滲脅迫而引起的血淋巴滲透壓驟降起到緩沖作用。
　　不同鹽度低滲脅迫實驗結(jié)果表明，環(huán)境鹽度