大鼠肝臟3α-羥類固醇脫氫酶cDNA的克隆與表達(dá).pdf

1、目的:大鼠肝臟3α-HSD[EC1.1.1.50]具有二氫二醇脫氫酶活性,利用該酶可對血清中的總膽汁酸含量進(jìn)行檢測.為獲得3α-HSD高表達(dá)工程菌株,也為開發(fā)3α-HSD的臨床應(yīng)用提供資料,該文對大鼠肝臟3α-HSD cDNA進(jìn)行了克隆、表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的純化,并初步對純化獲得的重組3α-HSD的酶活性進(jìn)行初步觀察.結(jié)果與討論:1、由于肝臟提取的總RNA有較好的完整性和較高的純度,紫外分光光度法定量測得樣品中RNA含量為2.88μg/μl

2、.pGEM-T/33α-HSD序列分析發(fā)現(xiàn)克隆獲得的3α-HSD與文獻(xiàn)報道的僅一個堿基差別,在起始密碼后的第814位T突變?yōu)镃.2、不同誘導(dǎo)表達(dá)條件的探索表明,32℃、1mmol/L TPTG、4h為最佳條件,可獲得高表達(dá),表達(dá)的融合蛋白占菌體可溶性總蛋白的37.9﹪.SDS-PAGE檢測融合蛋白分子量約為42KD,與融合蛋白pET-30a-c(+)/3α-HSD的預(yù)期分子量相吻合.重組融合蛋白主要以可溶形式存在于表達(dá)菌的胞質(zhì)中,采用親