羅非魚三種17β-羥類固醇脫氫酶(17β-HSD1,17β-HSD3,17β-HSD8)的克隆、表達(dá)及酶活性鑒定.pdf

1、首先從GeneBank下載在其他脊椎動(dòng)物中已被克隆17β-HSD1,173-HSD3的氨基酸和核甘酸序列,并在序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物,然后分別以羅非魚卵巢和精巢cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增得到17β-HSD1,17β-HSD3的中間片段.而17β-HSD8的3'端片段從羅非魚EST(expression sequence tags)克隆中獲得.通過(guò)篩選卵巢cDNA文庫(kù)獲得17β-HSD1全長(zhǎng)cDNA序列,而17β-HSD3和17

2、β-HSD8的全長(zhǎng)cDNA序列通過(guò)快速擴(kuò)增cDNA末端(RACE)和末端RT-PCR擴(kuò)增得到.從羅非魚克降的三種類型17β-羥類固醇脫氫酶(17β-HSD1,17β-HSD3,17β-HSD8)的cDNA全長(zhǎng)序列分別是:1054bp、1963bp、1006bp,其開放閱讀框編碼的氨基酸序列分別為:289AA、325AA、256AA.羅非魚的三種類型17β-HSDs在氨基酸水平上與其他已克隆的相應(yīng)17β-HSDs都有較高的同源性.通過(guò)三種

3、17β-HSD的基因特異性引物進(jìn)行RT-PCR分析和Northern雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),17β-HSD1的表達(dá)是卵巢特異性的,而17β-HSD3僅僅在精巢有表達(dá).17β-HSD8在雌雄的性腺、鰓、心臟、肝臟、腸和腎臟都有高水平表達(dá).在羅非魚14天的產(chǎn)卵周期中,17β-HSD1在卵巢的表達(dá)水平與卵子成熟過(guò)程中雌激素的水平密切相關(guān).同時(shí),17β-HSD1和17β-HSD3在個(gè)體發(fā)生過(guò)程中都是從孵化后50天左右才開始表達(dá),而此時(shí),羅非魚的性腺分化已

4、經(jīng)非常明顯,配子發(fā)生剛剛開始.由此表明,這兩種酶都可能在配子發(fā)生過(guò)程中有重要作用,而可能沒有參與性別決定和分化過(guò)程.而17β-HSD8早在胚胎發(fā)育的5天已經(jīng)開始表達(dá),因而可能在羅非魚性別分化的早期起重要作用.酶活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在E.coli細(xì)胞中表達(dá)的17β-HSD1/pET Blue2重組蛋白既能高效地催化A和T之間的相互轉(zhuǎn)化,同樣又能更高效地催化E1和E2之間的相互轉(zhuǎn)化.并且以NADP(H)為輔酶的轉(zhuǎn)化率稍高于NAD(H)存在的反

5、應(yīng),羅非魚17β-HSD1與哺乳類相似是NADP(H)依賴的.但羅非魚17β-HSD1重組蛋白催化從E2到E1的氧化反應(yīng)是不依賴輔酶的,即使沒有輔酶的存在,其轉(zhuǎn)化率同樣可以達(dá)到98.5％.而17β-HSD8轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞表達(dá)的17β-HSD8/pcDNA 3.1重組蛋白能微弱地催化E1和E2之間的相互轉(zhuǎn)化,同時(shí)也能催化從T到A的氧化反應(yīng).但在我們的實(shí)驗(yàn)中,不論是在原核細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá),還是通過(guò)轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞表達(dá)的羅非魚17β-HSD3重