馬鈴薯甲蟲(chóng)脯氨酸脫氫酶基因的克隆、表達(dá)分析及其dsRNA的發(fā)酵生產(chǎn).pdf

1、脯氨酸脫氫酶在昆蟲(chóng)中廣泛存在，其功能是氧化脯氨酸生成丙氨酸、二氧化碳和水。許多研究表明，脯氨酸脫氫酶主要參與了昆蟲(chóng)重要神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸和γ-氨基丁酸(GABA)的合成。但脯氨酸脫氫酶的另一功能--為鞘翅目昆蟲(chóng)的長(zhǎng)距離飛行提供直接能量--一直沒(méi)有受到應(yīng)有的重視。本論文主要研究了重要鞘翅目害蟲(chóng)馬鈴薯甲蟲(chóng)的脯氨酸脫氫酶基因，解析馬鈴薯甲蟲(chóng)脯氨酸脫氫酶的基因結(jié)構(gòu)，檢測(cè)脯氨酸脫氫酶基因在馬鈴薯甲蟲(chóng)越冬前后表達(dá)豐度的差異，并在得到馬鈴薯甲蟲(chóng)脯氨酸脫氫

2、酶基因干擾載體的基礎(chǔ)上利用微生物發(fā)酵技術(shù)大量獲得其dsRNA。本項(xiàng)研究對(duì)于更好的理解鞘翅目昆蟲(chóng)的長(zhǎng)距離飛行及馬鈴薯甲蟲(chóng)的防治，具有重要意義。
　　 一、馬鈴薯甲蟲(chóng)脯氨酸脫氫酶基因全長(zhǎng)的克隆
　　 根據(jù)其他昆蟲(chóng)的脯氨酸脫氫酶基因保守域序列設(shè)計(jì)兼并引物，擴(kuò)增出馬鈴薯甲蟲(chóng)脯氨酸脫氫酶基因的中心區(qū)段，結(jié)合5’RACE和3’RACE技術(shù)獲得該基因的1個(gè)5’端序列和3個(gè)3’端序列，經(jīng)序列拼接獲得3個(gè)長(zhǎng)度分別為2509bp、3076b

3、p、3231bp的脯氨酸脫氫酶可變剪接體，在GenBank中登錄號(hào)分別為GU355892、GU355893、GU355894，依次定名為脯氨酸脫氫酶基因轉(zhuǎn)錄異型體-1、2與3。序列分析結(jié)果表明，這3個(gè)可變剪接體均包含1個(gè)的開(kāi)放閱讀框，編碼616氨基酸，其理論上的等電點(diǎn)PI=8.87，相對(duì)分子質(zhì)量為7.07×104，聚類分析顯示其與已報(bào)道的其它昆蟲(chóng)的脯氨酸脫氫酶基因具有較高的氨基酸序列同源性。
　　 二、馬鈴薯甲蟲(chóng)脯氨酸脫氫酶基因

4、的表達(dá)分析
　　 經(jīng)過(guò)end-to-end PCR驗(yàn)證，進(jìn)一步證實(shí)了馬鈴薯甲蟲(chóng)脯氨酸脫氫酶的3個(gè)轉(zhuǎn)錄異型體是確實(shí)存在的。以基因組DNA為對(duì)照，越冬前后的馬鈴薯甲蟲(chóng)cDNA為模板來(lái)研究脯氨酸脫氫酶的3個(gè)轉(zhuǎn)錄異型體在越冬前后表達(dá)豐度的差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示脯氨酸脫氫酶基因的3個(gè)轉(zhuǎn)錄異型體在越冬前都呈低水平表達(dá)，而脯氨酸脫氫酶基因轉(zhuǎn)錄異型體-1在越冬后優(yōu)勢(shì)轉(zhuǎn)錄表達(dá)。正常情況下，基因在3'UTR的序列越長(zhǎng)，則其在細(xì)胞中的半衰期越短。這一結(jié)果

5、表明，為了適應(yīng)越冬后的長(zhǎng)距離飛行需要，馬鈴薯甲蟲(chóng)通過(guò)縮短3'UTR序列長(zhǎng)度的方式，達(dá)到延長(zhǎng)脯氨酸脫氫酶mRNA半衰期進(jìn)而來(lái)提高細(xì)胞中脯氨酸脫氫酶豐度的目的，以滿足長(zhǎng)距離飛行過(guò)程中高能量代謝的需求。
　　 三、sid-1基因cDNA片段的克隆與進(jìn)化分析
　　 通過(guò)生物信息學(xué)手段對(duì)NCBI EST數(shù)據(jù)庫(kù)中類sid-1基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，而后選取幾種重要農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)（馬鈴薯甲蟲(chóng)，灰飛虱，褐飛虱）的類sid-1基因進(jìn)行RACE PCR克隆

6、。在褐飛虱中得到1個(gè)1137bp的5‘端序列和1個(gè)1328bp的3‘端序列，拼接得到2786bp的cDNA全長(zhǎng)序列；在灰飛虱中得到1個(gè)792bp的5‘端序列和1個(gè)1766bp的3‘端序列，拼接得到2515bp的cDNA全長(zhǎng)序列；在馬鈴薯甲蟲(chóng)中得到1個(gè)350bp的5‘端序列。褐飛虱與灰飛虱類sid-1基因拼接序列的End-to-end PCR分別得到片段大小為2594bp與2322bp的產(chǎn)物，產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果與拼接得到的序列是一致的。與其他

7、物種類sid-1基因構(gòu)建的聚類樹(shù)狀圖表明拼接馬鈴薯甲蟲(chóng)類sid-1基因cDNA片段與已報(bào)道的其它昆蟲(chóng)的類sid-1基因具有較高的氨基酸序列同源性，且與赤擬谷盜距離最近，推測(cè)馬鈴薯甲蟲(chóng)也具有類sid-1基因，具備系統(tǒng)性RNA干擾的前提條件。
　　 四、應(yīng)用微生物發(fā)酵技術(shù)獲得馬鈴薯甲蟲(chóng)脯氨酸脫氫酶基因雙鏈RNA的初步研究
　　 在昆蟲(chóng)中，已有通過(guò)喂食dsRNA干擾靶標(biāo)基因來(lái)研究基因功能及達(dá)到植物保護(hù)目的的報(bào)道，而上述dsRN