馬鈴薯甲蟲(Leptinotarsadecemlineata)腺苷高半胱氨酸水解酶基因dsRNA應(yīng)用研究.pdf

1、馬鈴薯甲蟲Leptinotarsa decemlineata(Say)，又稱科羅拉多甲蟲或科羅拉多馬鈴薯葉甲，屬于鞘翅目的葉甲科，是世界性檢疫害蟲之一。自20世紀(jì)90年代傳入我國新疆地區(qū)以來，對我國的馬鈴薯生產(chǎn)構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。本試驗(yàn)通過測試表達(dá)馬鈴薯甲蟲腺苷高半胱氨酸水解酶dsRNA(dsSAHase)的大腸桿菌對馬鈴薯甲蟲的干擾作用，研究儲(chǔ)存條件對大腸桿菌菌液的影響，并初步探討馬鈴薯甲蟲體液對dsRNA的降解作用以及穩(wěn)定劑的開發(fā)。研究

2、結(jié)果對利用RNA干擾技術(shù)開發(fā)高效、專一性強(qiáng)、對人畜安全、對環(huán)境無污染的新型殺蟲劑具有一定意義。本研究主要內(nèi)容包括：
　?、興sSAHase對馬鈴薯甲蟲 RNA干擾效應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果：通過飼喂法將不同劑量dsSAHase導(dǎo)入馬鈴薯甲蟲體內(nèi)，運(yùn)用線性回歸方法測算各齡期 LC50；同時(shí)觀測飼喂后成蟲的產(chǎn)卵數(shù)，解剖觀察雌成蟲卵巢發(fā)育情況。dsSAHase對馬鈴薯甲蟲各齡期幼蟲的的LC50分別為：1齡2.341μg/ml，2齡2.552μg/ml

3、，3齡3.450μg/ml，4齡4.968μg/ml。飼喂dsSAHase后，馬鈴薯甲蟲成蟲表現(xiàn)為產(chǎn)卵極少或不產(chǎn)卵，其雌成蟲卵巢發(fā)育等級(jí)與產(chǎn)卵情況正相關(guān)。dsSAHase對馬鈴薯甲蟲幼蟲具有顯著致死作用、拒食作用以及抑制生長發(fā)育作用，各齡期幼蟲的毒力隨齡期增長而降低，對馬鈴薯甲蟲成蟲的繁殖能力具有顯著的抑制效果。
　?、撇煌瑑?chǔ)存條件對 dsSAHase生物活性的影響研究結(jié)果：將用超純水懸浮的表達(dá)dsSAHase的大腸桿菌E.coi

4、l菌體，分為滅活與不滅活兩個(gè)處理，分別于-20℃、4℃、室溫、37℃儲(chǔ)存24h、48h、72h，將未脫培養(yǎng)基的表達(dá) dsSAHase的大腸桿菌發(fā)酵液不滅活，在-20℃和室溫條件下儲(chǔ)存24h、48h、72h；將各處理大腸桿菌飼喂馬鈴薯甲蟲2齡幼蟲，檢測各因素對其活性的影響，明確其儲(chǔ)存條件。大腸桿菌脫培養(yǎng)基后低溫儲(chǔ)存24h后生物活性優(yōu)于新鮮菌，高溫儲(chǔ)存24h后仍有較高活性，儲(chǔ)存48h后效果減弱；大腸桿菌是否脫培養(yǎng)基在低溫下儲(chǔ)存對 dsRNA

5、活性影響不大，高溫下儲(chǔ)存影響較大；大腸桿菌脫培養(yǎng)基后儲(chǔ)存則溫度、是否滅活對活性影響不大。dsRNA大腸桿菌菌體在-20℃、4℃、室溫、37℃條件下可以在24h內(nèi)儲(chǔ)存。
　　⑶馬鈴薯甲蟲體液對dsRNA的降解作用及聚乙烯亞胺（PEI）對dsRNA的保護(hù)作用試驗(yàn)結(jié)果：馬鈴薯甲蟲中腸液及淋巴液與dsSAHase在不同溫度條件下體外孵育，觀測其作用結(jié)果；構(gòu)建聚乙烯亞胺(polyethyleneimine, PEI)PEI-dsSAHase

6、復(fù)合物，飼喂馬鈴薯甲蟲2齡幼蟲，觀測PEI對dsSAHase的增效作用。馬鈴薯甲蟲中腸液與淋巴液都降解dsSAHase，該降解作用受溫度影響較小。單體dsSAHase菌液飼喂馬鈴薯甲蟲2齡幼蟲死亡率為55％，而PEI-dsSAHase復(fù)合物飼喂馬鈴薯甲蟲2齡幼蟲死亡率達(dá)到75%。dsRNA會(huì)被馬鈴薯甲蟲體液部分降解，而PEI與dsRNA結(jié)合形成復(fù)合物，提高了dsRNA的穩(wěn)定性，抑制了dsRNA在蟲體內(nèi)的降解。馬鈴薯甲蟲腺苷高半胱氨酸水解