S-腺苷同型半胱氨酸水解酶在纖毛-鞭毛組裝及食管癌發(fā)生發(fā)展中的作用.pdf

1、食管鱗癌是我國(guó)最常見的惡性腫瘤之一，尤其是華北地區(qū)。雖經(jīng)過(guò)多年的研究，但其發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制仍不十分清楚。纖毛/鞭毛是進(jìn)化上非常保守的細(xì)胞器，鞭毛/纖毛不僅作為運(yùn)動(dòng)推動(dòng)器，而且也可作為一個(gè)細(xì)胞“天線”，接收來(lái)自其他細(xì)胞和環(huán)境的物理、化學(xué)信號(hào)，向細(xì)胞核傳遞這些信號(hào)以引起細(xì)胞反應(yīng)。纖毛結(jié)構(gòu)或功能上的異常導(dǎo)致一系列人類疾病的發(fā)生，包括腫瘤。作為引發(fā)多條信號(hào)通路活化的重要細(xì)胞器，纖毛在腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮重要作用，而鞭毛組裝和腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制目前

2、還不清楚。直接以人的纖毛為對(duì)象研究纖毛的組裝過(guò)程是困難的，大多數(shù)腫瘤細(xì)胞的纖毛都出現(xiàn)了缺失。因此我們以雙鞭毛無(wú)細(xì)胞壁的單細(xì)胞真核生物——杜氏鹽藻的鞭毛為模式細(xì)胞器來(lái)研究纖毛組裝機(jī)制在食管鱗癌發(fā)生中的作用。
　　纖毛/鞭毛是一個(gè)基于微管的細(xì)胞器，鞭毛內(nèi)運(yùn)輸(IFT)是目前研究比較清楚的纖毛/鞭毛組裝機(jī)制，但是其調(diào)控機(jī)制尚不明確。IFT的調(diào)控機(jī)制是一個(gè)精密且復(fù)雜的過(guò)程，肯定有多種調(diào)控途徑存在，而蛋白的翻譯后修飾是一種比較常見的調(diào)控手段

3、。蛋白翻譯后修飾包括磷酸化、乙?；⒍嗵腔?、氨基乙?；?、谷氨酰基化、甲基化。研究人員推測(cè)IFT馬達(dá)蛋白、IFT復(fù)合物及相關(guān)蛋白可能通過(guò)一種或多種翻譯后修飾來(lái)調(diào)節(jié)馬達(dá)蛋白自身的相對(duì)活性及其與IFT復(fù)合物蛋白、貨物(cargo)的相互作用。實(shí)際上，研究人員已發(fā)現(xiàn)蛋白磷酸化和去乙酰化在衣藻鞭毛和組織細(xì)胞初級(jí)纖毛的解聚中發(fā)揮著重要作用，且微管蛋白tubulin的乙酰化、去酪氨酸化(detyrosination)、谷氨酰化(glutamylati

4、on)、甘氨酰化（glycylation）在軸絲微管的組裝和維持中發(fā)揮重要作用。但是，關(guān)于纖毛/鞭毛蛋白甲基化方面的報(bào)導(dǎo)還比較少，Schneider等人在2008年在衣藻鞭毛重吸收過(guò)程中檢測(cè)到四個(gè)軸絲蛋白不對(duì)稱的雙甲基化，而Sloboda等人在完整的鞭毛中發(fā)現(xiàn)了三個(gè)高度甲基化蛋白，但這些蛋白的功能研究還未見報(bào)道。前期的研究表明，一些小的鳥苷三磷酸酶(GTPase)和蛋白磷酸酶2A的催化亞基在細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)中被甲基化。甲基化修飾可能會(huì)影響

5、蛋白-蛋白的相互作用或者酶的活性，從而對(duì)信號(hào)傳導(dǎo)和蛋白靶向的調(diào)節(jié)起關(guān)鍵作用。
　　保守的S-腺苷同型半胱胺酸水解酶(SAHH)是甲基化途徑中降解S-腺苷同型半胱胺酸(SAH)的唯一水解酶，SAH對(duì)甲基化通路具有反饋抑制作用，對(duì)SAHH的抑制會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)SAH的增多，從而導(dǎo)致對(duì)甲基化途徑的抑制。最近，SAHH抑制劑在抗病毒抗寄生蟲方面得到廣泛的關(guān)注，同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)一些人類疾病的發(fā)生與細(xì)胞內(nèi)SAHH水平的變化密切相關(guān)。例如，細(xì)胞內(nèi)SA

6、HH水平的異常會(huì)導(dǎo)致人類心血管疾病的發(fā)生，從2004年在南斯拉夫已經(jīng)發(fā)現(xiàn)7起致死事件是由于SAHH的異常造成的，2008年Leal等人通過(guò)全基因組功能缺失篩選出五個(gè)新的推測(cè)抑癌基因，SAHH就是其中之一，研究人員發(fā)現(xiàn)在包括直腸癌和肺癌在內(nèi)的腫瘤中SAHH表達(dá)下調(diào)。SAHH作為一個(gè)新的抑癌基因，它的抑癌作用是否與纖毛調(diào)控有直接或間接的關(guān)系呢？
　　Pazour等人通過(guò)質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)萊因衣藻的SAHH的肽段存在于其鞭毛的組分中，為了研究

7、纖毛在食管鱗癌發(fā)生中的作用，本研究以鞭毛再生過(guò)程中篩選出的差異表達(dá)基因SAHH為目的基因，從兩個(gè)方面對(duì)SAHH在胞內(nèi)可能發(fā)揮的功能進(jìn)行了研究:1、檢測(cè)SAHH在杜氏鹽藻鞭毛再生過(guò)程中的作用。2、觀察食管鱗癌組織和細(xì)胞株EC9706和Eca109中SAHH表達(dá)情況，構(gòu)建eGFP-N1-SAHH真核過(guò)表達(dá)，并觀察SAHH的過(guò)表達(dá)對(duì)食管鱗癌細(xì)胞株EC9706和Eca109的增殖、凋亡、侵襲、細(xì)胞周期及細(xì)胞形態(tài)的的影響。
　　第一部分:S

8、AHH在纖毛/鞭毛組裝中的作用
　　目的:
　　以杜氏鹽藻鞭毛為模式細(xì)胞器研究纖毛組裝在食管癌發(fā)生發(fā)展中的作用，構(gòu)建鞭毛再生模型，篩選鞭毛再生過(guò)程中差異表達(dá)基因，并研究其在鞭毛再生過(guò)程中的作用，為研究纖毛組裝在食管鱗癌中的作用奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　第一章杜氏鹽藻鞭毛組裝模型的構(gòu)建及差異基因的篩選
　　1、運(yùn)用pH休克的方法構(gòu)建杜氏鹽藻鞭毛再生過(guò)程;
　　2、提取野生型和pH休克后再生1h的杜氏鹽

9、藻細(xì)胞總RNA的通過(guò)Illumina高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序、組裝、注釋、功能分類，并篩選出差異表達(dá)基因。
　　第二章dsSAHH在杜氏鹽藻鞭毛組裝中的作用結(jié)果:
　　1、通過(guò)RACE巢式PCR擴(kuò)增篩選出來(lái)的dsSAHH全長(zhǎng)序列;
　　2、構(gòu)建pET28a(+)-dsSAHH原核表達(dá)載體，誘導(dǎo)dsSAHH蛋白的表達(dá)并制備其抗體;
　　3、通過(guò)Westernblotting和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-ti

10、mePCR)檢測(cè)dsSAHH檢測(cè)在鞭毛再生過(guò)程中蛋白水平和轉(zhuǎn)錄水平上的變化;
　　4、間接免疫熒光法檢測(cè)dsSAHH在杜氏鹽藻細(xì)胞中的定位。
　　5、構(gòu)建p7NBT-dsSAHH真核表達(dá)載體，觀察dsSAHH在杜氏鹽藻細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)對(duì)鞭毛再生的影響;
　　6、通過(guò)掃描電鏡觀察SAHH抑制劑DZA對(duì)杜氏鹽藻鞭毛再生的影響;
　　7、酵母雙雜技術(shù)篩選dsSAHH互作蛋白，并由體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其相互作用。
　　結(jié)果

11、：
　　第一章杜氏鹽藻鞭毛組裝模型的構(gòu)建及差異基因的篩選
　　1、運(yùn)用pH休克的方法構(gòu)建杜氏鹽藻鞭毛再生過(guò)程;
　　2、提取野生型和pH休克后再生1h的杜氏鹽藻細(xì)胞總RNA的通過(guò)Illumina高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序、組裝、注釋、功能分類，并篩選出差異表達(dá)基因。
　　第二章dsSAHH在杜氏鹽藻鞭毛組裝中的作用
　　1、經(jīng)3'和5'RACE擴(kuò)增后，得到一個(gè)全長(zhǎng)為1，926bp的cDNA片段，其中包括

12、1，458bp的ORF，編碼458個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)的分子量為52.8kD，等電點(diǎn)(pI)為5.70;
　　2、16℃過(guò)夜培養(yǎng)，1mMIPTG成功誘導(dǎo)可溶性dsSAHH蛋白的表達(dá)，并制備其抗體，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn);
　　3、Real-timePCR和westernblotting結(jié)果顯示:杜氏鹽藻dsSAHH基因在鞭毛再生過(guò)程中在蛋白水平和轉(zhuǎn)錄水平都表達(dá)上調(diào);
　　4、間接免疫熒光結(jié)果顯示:dsSAHH不僅存在于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)

13、，在鞭毛內(nèi)也有定位;
　　5、在dsSAHH過(guò)表達(dá)的杜氏鹽藻細(xì)胞株中，pH休克后其鞭毛再生時(shí)間縮短，表明dsSAHH能促進(jìn)杜氏鹽藻鞭毛的再生;
　　6、經(jīng)SAHH抑制劑DZA(25μM)處理后，杜氏鹽藻鞭毛不能再生，表明SAHH抑制劑DZA處理能抑制鞭毛再生。
　　7、酵母雙雜實(shí)驗(yàn)篩選出與dsSAHH相互作用的蛋白dsRACK1，并通過(guò)pulldown和免疫共沉淀等實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了它們相互作用。
　　小論:
　　

14、通過(guò)pH休克的方法我們成功構(gòu)建了杜氏鹽藻鞭毛再生模型，RNA-seq測(cè)序篩選出鞭毛再生過(guò)程中的差異unigene25，373個(gè)，有注釋的7，476個(gè)。差異基因dsSAHH在杜氏鹽藻鞭毛再生過(guò)程中表達(dá)量上調(diào)，它在杜氏鹽藻細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)能促進(jìn)鞭毛的再生，而其抑制劑DZA能抑制鞭毛再生。
　　第二部分SAHH在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用
　　目的:
　　研究SAHH作為新預(yù)測(cè)的抑癌基因在是食管鱗癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)情況，鑒于前

15、面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察人源S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(hSAHH)的過(guò)表達(dá)對(duì)食管鱗癌細(xì)胞凋亡、增殖、粘附、遷移能力及細(xì)胞周期、細(xì)胞形態(tài)的影響，初步鑒定SAHH對(duì)食管鱗癌的作用是否與纖毛相關(guān)。
　　方法:
　　第一章SAHH在正常食管上皮細(xì)胞和食管鱗癌細(xì)胞中的表達(dá)差異
　　1、分別提取正常食管上皮細(xì)胞Het-1A和食管鱗癌細(xì)胞EC9706和Eca109的總蛋白和mRNA，Westernblotting和real-timePCR

16、檢測(cè)hSAHH在各中的表達(dá)。
　　2、免疫組化檢測(cè)hSAHH食管鱗癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)。
　　第二章SAHH過(guò)表達(dá)對(duì)食管鱗癌細(xì)胞的影響
　　1、構(gòu)建pEGFP-N1-SAHH真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染食管鱗癌細(xì)胞株和正常食管上皮細(xì)胞;
　　2、分別用Westernblotting、細(xì)胞S腺苷同型半胱氨酸(SAH或AdoHcy)酶連續(xù)循環(huán)比色法定量檢測(cè)試劑盒和同型半胱氨酸(Hcy)檢測(cè)試劑盒檢測(cè)SAHH過(guò)表達(dá)后細(xì)胞

17、內(nèi)SAHH、SAH和Hcy水平;
　　3、使用EdU細(xì)胞增殖試劑盒，經(jīng)Apollo(@)和Hoechst33342染色，利用熒光顯微鏡觀察SAHH過(guò)表達(dá)細(xì)胞的增殖;
　　4、以TUNEL法和Westernblotting檢測(cè)SAHH過(guò)表達(dá)的食管鱗癌細(xì)胞株和正常食管上皮細(xì)胞的凋亡情況;
　　5、細(xì)胞經(jīng)PI染色，用FCM法測(cè)定SAHH過(guò)表達(dá)前后細(xì)胞周期分布;
　　6、利用Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SAHH過(guò)表

18、達(dá)細(xì)胞的遷移能力;
　　7、掃描電鏡觀察SAHH的過(guò)表達(dá)對(duì)食管鱗癌細(xì)胞纖毛的影響。
　　8、Co-IP驗(yàn)證人源SAHH和RACK1的相互作用，Westernblotting檢測(cè)SAHH過(guò)表達(dá)后RACK1的變化情況。
　　結(jié)果:
　　第一章SAHH在正常食管上皮細(xì)胞和食管鱗癌細(xì)胞中的表達(dá)差異
　　1、免疫組化和real-timePCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，hSAHH在食管鱗癌組織與癌旁正常組織中都有表達(dá)，但是在食管鱗

19、癌組織中表達(dá)下調(diào);
　　2、與正常食管上皮細(xì)胞Het-1A相比，Eca109和EC9706細(xì)胞中SAHH在mRNA水平上分別上升28.8％和42.2％(P＜0.05)，而蛋白水平則分別降低13.5％(P＜0.05)和53.6％(P＜0.001);
　　第二章hSAHH過(guò)表達(dá)對(duì)食管鱗癌細(xì)胞的影響
　　1、成功構(gòu)建EGFP-N1-SAHH真核表達(dá)載體，在食管鱗癌細(xì)胞株和正常食管上皮Het-1A中的轉(zhuǎn)染率達(dá)90％以上;

20、>　　2、與轉(zhuǎn)染pEGFP-N1的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-SAHH的Eca109、EC9706和Het-1A細(xì)胞內(nèi)SAHH蛋白表達(dá)顯著升高(P＜0.05)。與此同時(shí)，Eca109、EC9706細(xì)胞內(nèi)SAH濃度顯著降低而Hcy濃度顯著增加(P＜0.05）;而轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-SAHH的Het-1A細(xì)胞相對(duì)轉(zhuǎn)染pEGFP-N1的細(xì)胞SAH和Hcy濃度變化不明顯（P＞0.05）;
　　3、Westernblotting結(jié)果顯

21、示，與轉(zhuǎn)染pEGFP-N1的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-SAHH的Eca109和EC9706內(nèi)凋亡因子caspase-3分別增加～1.6倍和～3.15倍(P＜0.05);TUNEL試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-SAHH的Eca109和EC9706的細(xì)胞凋亡率分別為6.749±0.045％和9.869±0.078％(P＜0.05)，而轉(zhuǎn)染pEGFP-N1的Eca109和EC9706的細(xì)胞凋亡率分別為1.777±0.011％和2.9

22、67±0.053％;
　　4、EdU實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SAHH的過(guò)表達(dá)對(duì)Eca109和EC9706細(xì)胞的增殖及細(xì)胞在G0/G1、S和G2/M期的分布的影響不顯著(P＞0.05);
　　5、Westernblotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)粘附因子E-cadherin在轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-SAHH的Eca109和EC9706的細(xì)胞中表達(dá)量增加而ICAM-1則隨著SAHH表達(dá)量增加而減少;在Transwell小室實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)染pE

23、GFP-N1-SAHH的Eca109和EC9706細(xì)胞遷移數(shù)為124.17±41.32和73.25±13.38而轉(zhuǎn)染pEGFP-N1的Eca109和EC9706的遷移細(xì)胞數(shù)為205.25±28.19和173.33±38.28(P＜0.05)，表明SAHH的過(guò)表達(dá)能抑制食管鱗癌細(xì)胞的遷移;
　　6、掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)SAHH過(guò)表達(dá)對(duì)食管鱗癌細(xì)胞纖毛的影響不明顯;
　　7、Co-IP證實(shí)人源SAHH與RACK1在體內(nèi)也是相互作用的

24、，并且RACK1在ESCC細(xì)胞株中表達(dá)量隨著SAHH表達(dá)量增多而增多（P＜0.05）。
　　小論:
　　高度保守的hSAHH基因在食管鱗癌組織和細(xì)胞中都呈現(xiàn)出表達(dá)量下降，本研究中對(duì)其在食管鱗癌細(xì)胞株Eca109和EC9706中的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致了細(xì)胞內(nèi)SAH濃度下降而Hcy濃度增加，促進(jìn)了食管鱗癌細(xì)胞的凋亡，抑制了其遷移和粘附，但是對(duì)其增殖和細(xì)胞周期分別沒(méi)有顯著影響。此外，hSAHH蛋白與骨架蛋白hRACK1無(wú)論在杜氏鹽藻細(xì)胞中還