S-腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHH)的克隆表達(dá)純化、酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)分析及其抑制劑篩選.pdf

1、高半胱氨酸(Hcy)，一種典型的含有巰基的氨基酸。當(dāng)體內(nèi)Hcy含量異常升高時(shí)會(huì)嚴(yán)重?fù)p害DNA的修復(fù)機(jī)制，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，甚至還會(huì)引起阿爾茨海默綜合癥(Alzheimer's disease，AD)、高半胱氨酸血癥、冠心病等。體內(nèi)Hcy的生成是由S-腺苷高半胱氨酸水解酶(S-adenosyl-homocysteine hydrolase，SAHH，E.C.3.3.1.1)催化S-腺苷高半胱氨酸(S-adenosylhomocystein，

2、SAH)可逆水解生成腺苷(Ado)和Hcy。細(xì)胞中Hcy的生成只有水解SAH這唯一的一條代謝途徑，所以體內(nèi)Hcy含量的高低與SAHH蛋白酶有著密切的關(guān)系。本論文旨在通過(guò)體外合成具有生物活性的SAHH，并且以該SAHH為研究基礎(chǔ)篩選得到可以抑制SAHH活性的抑制劑。此抑制劑有可能為治療以及防止AD、高半胱氨酸血癥、冠心病等老年性疾病提供了新的、更有效的臨床治療方法。
　　本論文通過(guò)基因工程技術(shù)將sahh克隆到pPic9k質(zhì)粒中構(gòu)建p

3、PIC9K-sahh重組表達(dá)質(zhì)粒。該重組表達(dá)質(zhì)粒在限制性內(nèi)切酶—BglⅡ的作用下酶切，酶切后目的基因通過(guò)電轉(zhuǎn)化的方法整合到畢赤酵母菌(P.pastoris) GS115的基因組。為了得到高抗性的轉(zhuǎn)化子，利用不同梯度濃度的G418遺傳霉素進(jìn)行高抗性篩選，最終篩選得到高拷貝、高抗性的轉(zhuǎn)化子。將篩選到的高拷貝轉(zhuǎn)化子通過(guò)菌體的PCR進(jìn)行擴(kuò)增，鑒定其為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化子。將得到的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子并在1％的甲醇誘導(dǎo)下表達(dá)目的蛋白SAHH。隨后收集目的蛋白進(jìn)行鎳

4、柱純化，純化后的SAHH用5，5-二硫二硝基苯甲酸（DTNB）定量的檢測(cè)其酶活，其比活（aspec）為0.366 U/mg。為了進(jìn)一步更好的了解此酶，本論文還進(jìn)行了酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究，探究得到該水解酶的Km=21.8μM，VMx=22.9μM/min，最適反應(yīng)溫度為41℃，最適反應(yīng)的pH為6.5。
　　本研究充分利用ChemMapper、SciFinder Scholar等信息平臺(tái)來(lái)進(jìn)行抑制劑的初步篩選。通過(guò)DTNB試劑檢測(cè)其酶活